赤痢菌による上皮細胞感染解析

要約

現在のプロトコルはin vitroの上皮細胞ラインを使用して赤痢菌の付着、侵入および細胞内複製を調査する伝染の試金を記述する。

要約

ヒトに適応した腸内細菌性病原体である赤痢菌は、毎年何百万人もの感染症を引き起こし、小児患者に長期的な増殖効果をもたらし、世界中で下痢による死亡の主な原因となっています。感染は、病原体が消化管を通過し、結腸を覆う上皮細胞に感染する結果として、水様または血性の下痢を誘発します。抗生物質耐性菌の驚異的な増加と承認されたワクチンの不足により、この手ごわい病原体を研究するには、標準化された研究プロトコルが不可欠です。ここでは、結腸上皮細胞における細菌の付着、浸潤、および細胞内複製のin vitro分析を使用して、赤痢菌の分子病因を調べるための方法論を紹介します。感染分析に先立ち、赤痢菌コロニーの病原性表現型は、寒天プレート上のコンゴ赤色色素の取り込みによって検証されました。また、バクテリア培養中にin vivo条件を模倣するために、サプリメントを添加した実験用培地を検討することもできます。次に、細菌細胞を標準化されたプロトコルで使用し、感染の各段階を分析するための適応を伴う感染の確立された多様性で、組織培養プレート内の結腸上皮細胞に感染します。アドヒアランスアッセイでは、赤痢菌細胞を培地レベルを下げてインキュベートし、細菌と上皮細胞との接触を促進します。浸潤アッセイと細胞内複製アッセイの両方で、ゲンタマイシンをさまざまな時間間隔で適用して細胞外細菌を排除し、浸潤の評価および/または細胞内複製速度の定量化を可能にします。すべての感染プロトコルは、感染した上皮細胞溶解物を段階的に希釈し、コンゴ赤寒天プレート上の感染力価と比較して細菌コロニー形成単位をめっきすることにより、付着細菌、侵入細菌、および/または細胞内細菌を列挙します。これらのプロトコルを組み合わせることで、上皮細胞の赤痢菌感染の各段階について、独立した特性評価と比較が可能になり、この病原体の研究に成功します。

概要

腸内細菌性病原体によって引き起こされる下痢性疾患は、世界的な健康上の重大な負担です。2016年、下痢性疾患は世界で130万人の死亡の原因となり、5歳未満の子供の死因の第4位でした^1,2。グラム陰性腸内細菌性病原体である赤痢菌は、世界中で下痢による死亡の主な原因である赤痢症の原因物質です³。赤痢症は、低・中^{所得国の子ども}に毎年重大な罹患率と死亡率を引き起こし^4,5、高所得国での感染は、保育所、食品媒介、水媒介の発生に関連しています^6,7,8,9。効果のないワクチン開発¹⁰と薬剤耐性(AMR)^11,12の上昇により、大規模な赤痢菌の集団発生の管理が複雑になっています。米国疾病管理予防センター(CDC)の最....

プロトコル

1. 試薬・材料の調製

注:すべての容量は、2 枚の 6 ウェルプレートを使用したアッセイと一致しています。

1. TSB培地:0.5 Lの脱イオン(DI)水を15 gのトリプシン大豆ブロス(TSB、 材料表を参照)培地とオートクレーブに加えます。室温で保存してください。
2. 胆汁塩培地(TSB + BS):0.4%(w/v)胆汁塩を含むTSBを調製するには、0.06 gの胆汁塩(BS、 材料表を参照)を15 mLのオートクレーブ滅菌したTSBに再懸濁します。0.22μmのPESフィルターを使用してフィルター滅菌します。
   注:胆汁塩は、コール酸ナトリウムとデオキシコール酸ナトリウムの1:1混合物で構成されています。使用直前に新しいメディアを準備してください。
3. DMEM + 10% (v/v) FBS: 5 mL のウシ胎児血清 (FBS) を 45 mL の Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) に加えます。4°Cで保存してください。
4. DMEM + ゲンタマイシン:50 mL チューブに 50 mL の DMEM と 50 μL の 50 mg/mL ゲンタマイシンを加えます( 材料表を参照)。
   注:各実験の前に、新鮮なアリ....

ディスカッション

このプロトコルは一組の腸の上皮セルの赤痢菌の付着、侵入および細胞内の複製を調査する3つの標準化された試金を記述する。これらの方法は、宿主細胞内のさまざまな細菌性病原体の侵入および細胞内複製を研究するために使用される古典的なゲンタマイシンアッセイの単なる修正版ですが^49,50,51、赤痢菌を研究する際には.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm PES filter	Millipore-Sigma	SCGP00525	Sterile, polyethersulfone filter for sterilizing up to 50 mL media
14 mL culture tubes	Corning	352059	17 mm x 100 mm polypropylene test tubes with cap
50 mL conical tubes	Corning	430829	50 mL clear polypropylene conical bottom centrifuge tubes with leak-proof cap
6-well tissue culture plates	Corning	3516	Plates are treated for optimal cell attachment
Bile salts	Sigma-Aldrich	B8756	1:1 ratio of cholate to deoxycholate
Congo red dye	Sigma-Aldrich	C6277	A benzidine-based anionic diazo dye, >85% purity
Countess cell counting chamber slide	Invitrogen	C10283	To be used with the Countess Automated Cell Counter
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418	A a highly polar organic reagent
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	10569-010	DMEM is supplemented with high glucose, sodium pyruvate, GlutaMAX, and Phenol Red
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F4135	Heat-inactivated, sterile
Gentamicin	Sigma-Aldrich	G3632	Stock concentration is 50 mg/mL
HT-29 cell line	ATCC	HTB-38	Adenocarcinoma cell line; colorectal in origin
Paraffin film	Bemis	PM999	Laboratory sealing film
Petri dishes	Thermo Fisher Scientific	FB0875713	100 mm x 15 mm Petri dishes for solid media
Phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010049	1x concentration; pH 7.4
Select agar	Invitrogen	30391023	A mixture of polysaccharides extracted from red seaweed cell walls to make bacterial plating media
T75 flasks	Corning	430641U	Tissue culture flasks
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	A common non-ionic surfactant and emulsifier
Trypan blue stain	Invitrogen	T10282	A dye to detect dead tissue culture cells; only live cells can exclude the dye
Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056	Reagent for cell dissociation for cell line maintenance and passaging
Tryptic Soy Broth (TSB)	Sigma-Aldrich	T8907	Bacterial growth media