In vivoアプリケーションのためのヨジキサノール密度勾配遠心分離によるアデノ随伴ウイルスの浮遊培養産生と精製

要約

アデノ随伴ウイルスは浮遊細胞培養で産生され、二重ヨージキサノール密度勾配遠心分離によって精製されます。ウイルスの総収量を増やし、ウイルス沈殿のリスクを低減し、最終的なウイルス生成物をさらに濃縮するためのステップが含まれています。予想される最終力価は^10,12 ウイルス粒子/mLに達し、前臨床 in vivo での使用に適しています。

要約

このプロトコルはiodixanol密度勾配の遠心分離、1999年に最初に記述されているAAVを浄化する血清型不可知論者方法によって組換えのadeno準のウイルス(rAAV)の生産そして浄化を記述する。rAAVベクターは、さまざまなヒト細胞タイプに導入遺伝子を送達するための遺伝子治療アプリケーションで広く使用されています。本研究では、導入遺伝子、ベクターカプシド、およびアデノウイルスヘルパー遺伝子をコードするプラスミドを用いた浮遊培養中の Expi293 細胞のトランスフェクションにより、組換えウイルスを産生します。ヨウジオジキサノール密度勾配遠心分離は、粒子密度に基づいて完全なAAV粒子を精製します。さらに、この今ではユビキタスな方法論には、総ウイルス収量の増加、汚染タンパク質による沈殿のリスクの低減、および最終的なウイルス生成物のさらなる濃縮のために、それぞれ3つのステップが含まれています:ポリエチレングリコール(PEG)と塩化ナトリウムの溶液を使用した細胞培地からのウイルス粒子の沈殿、2回目のヨージキサノール密度勾配遠心分離の導入、 遠心フィルターによる緩衝液交換。この方法を用いることで、in vivoでの使用において、10〜¹²個のウイルス粒子/mLの並外れた純度の力価を一貫して達成することができます。

概要

組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクターは、脊髄性筋萎縮症、網膜ジストロフィー、血友病A1,2,3などの遺伝性疾患の治療に広く使用されているツールです。rAAVベクターは、直鎖状の一本鎖4.7 kbのDNAゲノムを持つ小型の非エンベロープ正二十面体ウイルスである野生型AAV⁴に存在するウイルス遺伝子を欠くように操作されています。AAVは、1960年代にアデノウイルス製剤の汚染物質として初めて^{発見されました5}。AAVはキャプシドサイズが小さいため、パッケージ化できる導入遺伝子のサイズはITRを除いて最大4.9 kbに制限されます^が6、ヒトでは非病原性であり、多くの分裂細胞および非分裂細胞タイプで導入遺伝子の発現を可能にし、免疫原性効果が限られているため、導入遺伝子の送達に有用です⁷。

dependoparvovirus属のメンバーとして、rAAVの産生は、アデノウイルスまたは単純ヘルペスウイルスに存在するヘルパー遺伝子の発現に依存しています⁸。rAAVを....

プロトコル

このプロトコルで使用した溶液および緩衝液の組成を 表1に示します。

解決	組成
AAV溶解バッファー	1.2 mL の 5 M NaCl 溶液
	2 mL の 1 M Tris-HCl pH 8.5 溶液
	80 uL の 1 M MgCl2 溶液
	mQ 水から 40 mL まで
AAV沈殿液	40グラムペグ8000
	50 mL の 5 M NaCl 溶液
	mQ 水から 100 mL

ディスカッション

ダブルヨージキサノール密度勾配精製プロトコルは、受容体の特異性に関係なく、あらゆるAAV変異体バリアントに適用できるため、普遍的な方法です。AAV精製の初期の方法は粒子密度に依存しており、CsClでのアイソピクニック遠心分離と連続スクロース密度勾配遠心分離が含まれていました¹⁹。その後、セファロースカラムに結合したモノクローナル抗体を利用した血清型?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5810 R benchtop centrifuge	Eppendorf	22625501
8-channel peristaltic pump	Watson-Marlow	020.3708.00A
Automated cell counter	NanoEntek	EVE-MC
Avanti J-E high-speed centrifuge	Beckman Coulter	369001
Benzonase	Thermo Scientific	88701
Biological safety cabinet	Labconco	322491101
CO2 incubator with shaker			Set at 8% CO2 and 37 °C
Conical centrifuge tubes	Thermo Scientific	339652	50 mL
Conical centrifuge tubes	Thermo Scientific	339650	15 mL
Disposable micro-pipets	Fisherbrand	21-164-2G	Capillaries
Dulbecco's phosphate buffered saline without CaCl2 and MgCl2  (DPBS) (10x)	Sigma-Aldrich	D1408
ECLIPSE Ts2R-FL inverted microscope	Nikon
Expi293 Expression Medium	Gibco	A1435101
Expi293F cells	Gibco	A14527
Filter tips	USA Scientific	1126-7810	1000 µL
Filter tips	USA Scientific	1120-8810	200 µL
Filter tips	USA Scientific	1120-1810	20 µL
Filter tips	USA Scientific	1121-3810	10 µL
Hypodermic needles	Tyco Healthcare	820112	20 GA x 1-1/2 A
Ice bucket with lid	VWR	10146-184
JS-5.3 rotor	Beckman Coulter	368690
Magnesium chloride solution (1 M)	Millipore Sigma	M1028-100ML
Metal stand and clamp	Fisherbrand	05-769-6Q
Microcentrifuge tubes	Eppendorf	22600028	1.5 mL
Needle nose pliers
Optima XE-90 ultracentrifuge	Beckman Coulter	A94471
Opti-MEM I Reduced-Serum Medium	Gibco	31985062
OptiPrep density gradient media (iodixanol)	Serumwerk	AXS-1114542	60% iodixanol solution
P1000 Pipet	Gilson	F144059M
P2 Pipet	Gilson	F144054M
P20 Pipet	Gilson	F144056M
P200 Pipet	Gilson	F144058M
Phenol red solution	Sigma-Aldrich	P0290
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P4474
Pipet-Aid XP pipette controller	Drummond Scientific	4-000-101
Plasmid pCapsid	De novo or Addgene, etc.	N/A	We used pACGrh74.
Plasmid pHelper	Addgene	112867
Plasmid pTransgene	De novo or Addgene, etc.	N/A	We used pdsAAV-GFP.
Pluronic F-68 polyol solution (10%)	Mp Biomedicals	92750049
Polyethylene glycol 8000	Research Products International	P48080-500.0
Polyethylenimine HCl Max (PEI-Max)	Polysciences	NC1038561	Dilute in water to 40 μM
Polypropylene centrifuge tubes, sterile	Corning	431123	500 mL
Polypropylene centrifuge tubes, sterile	Corning	430776	250 mL
Polypropylene Optiseal tubes	Beckman Coulter	361625
Serological pipettes	Alkali Scientific	SP250-B	50 mL
Serological pipettes	Alkali Scientific	SP225-B	25 mL
Serological pipettes	Alkali Scientific	SP210-B	10 mL
Serological pipettes	Alkali Scientific	SP205-B	5 mL
Shaker flasks	Fisherbrand	PBV1000	1 L
Shaker flasks	Fisherbrand	PBV50-0	500 mL
Shaker flasks	Fisherbrand	PBV250	250 mL
Shaker flasks	Fisherbrand	PBV12-5	125 mL
Sodium chloride solution (5 M)	Fisher Scientific	NC1752640
Sterile syringes	Fisherbrand	14-955-458	5 mL
Syringe filter	Millipore	SLGV013SL	0.22 micron
Tris-HCl pH 8.5 (1 M)	Kd Medical	RGE3363
Trypan blue solution	Gibco	15250061
Tube rack assembly	Beckman Coulter	361646
Tube spacers (x4)	Beckman Coulter	361669
Tubing for peristaltic pump	Fisher Scientific	14190516
Type 70 Ti fixed-angle titanium rotor	Beckman Coulter	337922
Ultra low temperature freezer			Set at -70 °C
Vivaspin 20 centrifugal concentrator	Sartorius	VS2041
Water bath			Set at 37 °C