腰椎貯水槽注射による幼若ラットの髄腔内ベクター送達

要約

幼若ラットの腰椎槽に注射を行うための外科的処置が記載されている。このアプローチは、遺伝子治療ベクターの髄腔内送達に使用されてきましたが、このアプローチは、細胞や薬物を含むさまざまな治療に使用できることが期待されています。

要約

遺伝子治療は、機能遺伝子の導入、毒性遺伝子の不活性化、または製品の疾患生物学を調節できる遺伝子の提供など、疾患の治療のために患者に新しい遺伝子を送達するための強力な技術です。治療用ベクターの送達方法は、全身送達のための静脈内注入から標的組織への直接注入まで、さまざまな形態をとることができます。神経変性疾患の場合、形質導入を脳や脊髄に偏らせることが望ましいことがよくあります。中枢神経系全体を標的とする最も侵襲性の低いアプローチには、脳脊髄液(CSF)への注射が含まれ、治療薬が中枢神経系の大部分に到達することを可能にします。CSFにベクターを送達する最も安全なアプローチは、針を脊髄の腰椎槽に導入する腰椎髄腔内注射です。この技術は、腰椎穿刺とも呼ばれ、新生児や成体のげっ歯類、および大型動物モデルで広く使用されています。この手法は種や発生段階によって似ていますが、髄腔内空間を取り巻く組織のサイズ、構造、弾力性の微妙な違いにより、アプローチには適応が必要です。この記事では、アデノ随伴血清型9ベクターを送達するために、幼若ラットに腰椎穿刺を行う方法について説明します。ここでは、25〜35μLのベクターを腰椎槽に注入し、緑色蛍光タンパク質(GFP)レポーターを使用して、各注入から生じる形質導入プロファイルを評価しました。このアプローチの利点と課題について説明します。

概要

近年、脊髄性筋萎縮症、網膜ジストロフィー、第IX因子血友病、がんなどの治療薬がFDAに承認されたことで、ウイルス媒介性遺伝子治療の有望性がついに実現されました1,2,3,4。現在、他にも数え切れないほどの治療法が開発されています。遺伝子治療は、治療用遺伝子を患者さんの細胞に届けることを目的としています。この新しい遺伝子の産物は、欠損した内因性遺伝子の欠落した活性を補ったり、毒性遺伝子を阻害したり、がん細胞を殺したり、その他の有益な機能を提供したりすることができます。

中枢神経系(CNS)に影響を与える疾患では、遺伝子治療ベクターを標的組織に直接送達することが望ましい場合が多いです。非全身的アプローチは、末梢形質導入によって引き起こされる可能性のあるオフターゲット副作用を最小限に抑えることと、^{標的組織5}で適切なレベルの形質導入を達成するために必要なベクターの量を大幅に減少させるという2つの利点を提供する。

遺伝子治療ベクターをCNSに送達するには、さまざまなアプローチがあります。実質内注射は、ベクターを脊髄または脳組織に直....

プロトコル

この研究は、エモリー大学の施設内動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。本研究では、Sprague-Dawleyラット(生後28-30日齢、体重約90-135g、雄と雌)を用いた。

1. ベクターの調製

1. 手順の開始時に、AAV9ベクター( 材料の表を参照)を氷上で解凍します。
2. ベクターを含む微量遠心チューブを卓上型遠心分離機で短時間遠心分離し、すべての液体がチューブの底にあることを確認します。
3. 微量遠心チューブを静かにフリックして、溶液が十分に混合されていることを確認します。

2.リカバリーケージの準備

1. 清潔なケージを電気毛布( 材料の表を参照)に置き、ケージの半分だけが毛布に接触するようにします。
2. ブランケットの温度を~37°Cに設定します。

3.手術台の準備

1. 等温パッド( 材料の表を参照)を電子レンジまたはウォーターバスで39°Cに温め、内容物が液体になるようにします。
2. 等温パッ....

ディスカッション

CNSにはさまざまな疾患が罹患しています。ウイルスベクターを介して関連遺伝子の機能的コピーを提供することは、脊髄性筋萎縮症など、本質的に劣性で単一遺伝子である患者にとって魅力的な治療戦略です。ただし、血液脳関門 (BBB) は、静脈内投与されるほとんどの遺伝子治療ベクターを除外します¹¹。AAV9のようなBBBを通過できるものは、末梢形質導入によるベクター損.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 µL filtered pipette tips	MidSci	PR-200RK-FL	Pipetting virus
AAV9-GFP	Vector Builder	P200624-1005ynr	AAV9 vector expressing GFP
Absorbable Suture with Needle Coated Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Size 4 - 0 Braided	McKesson	J422H	Suture
Bench pad	VWR	56616-031	Surgery
Braintree Scientific Isothermal Pads, 8'' x 8''	Fisher Scientific	50-195-4664	Maintains body temperature
Buprenorphine	McKesson	1013922	Analgesic
Buprenorphine-ER (1 mg/mL)	Zoopharma		Extended-release analgesic
Cotton swabs	Fisher Scientific	19-365-409	Blood removal
Drape, Mouse, Clear Plastic, 12" x 12", with Adhesive Fenestration	Steris	1212CPSTF	Surgical drape
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20	Forceps
Electric Blanket	CVS Health		CVS Health Series 500 Extra Long Heating Pad
Eppendorf Research plus, 1-channel pipette, variable, 20–200 µL	Eppendorf	3123000055	Pipetting virus
Fine Scissors	Fine Science Tools	14059-11	Curved surgical scissors
Friedman-Pearson Rongeurs	Fine Science Tools	16121-14	Laminectomy
Halsey Needle Holders	Fine Science Tools	12001-13	Needle driver
Insulin Syringes with Ultra-Fine Needle 12.7 mm x 30 G 3/10 mL/cc	BD	328431	Syringe
Isoflurane	McKesson	803250	Anesthetic
Isopropanol wipes	Fisher Scientific	22-031-350	Skin disinfection
Lidocaine, 1%	McKesson	239935	Local anesthesia
Microcentrifuge Tubes: 1.5mL	Fisher Scientific	05-408-137	Loading the syringe
Povidone-iodine	Fisher Scientific	50-118-0481	Skin disinfection
Scalpel Handle - #4	Fine Science Tools	10004-13	Scalpel blade holder
Sure-Seal Induction Chamber	Braintree Scientific	EZ-17	Anesthesia box
Surgical Blade Miltex Carbon Steel No. 11 Sterile Disposable Individually Wrapped	McKesson	4-111	#11 Scalpel blade
SYSTANE NIGHTTIME Eye Ointment	Alcon		Eye ointment
Trypan Blue	VWR	97063-702	Injection