マウス鎖骨上褐色脂肪組織の解剖、組織学的処理、遺伝子発現解析

要約

ここでは、マウスの鎖骨上褐色脂肪組織の組織学的および遺伝子発現解析を解剖および実行するための実用的な手順を提供します。

要約

褐色脂肪組織(BAT)を介した熱産生は、代謝の制御に重要な役割を果たしており、その形態と機能は、マウスやヒトの環境刺激によって大きく影響を受けます。現在、マウスの背側上部の2つの肩甲骨の間に位置するマウス肩甲間BAT(iBAT)は、研究室がBAT機能を研究するために使用する主要なBATデポです。最近、これまで知られていなかったいくつかのBATデポがマウスで同定され、その中にはヒト鎖骨上褐色脂肪組織に類似したものも含まれていました。iBATとは異なり、マウス鎖骨上褐色脂肪組織(scBAT)は頸部の中間層に位置するため、簡単にアクセスすることはできません。

新たに同定されたマウスscBATの研究を容易にするために、出生後および成体マウスから無傷のscBATを解剖する手順を詳述したプロトコルを本明細書に提示する。scBATは他の脂肪デポに比べてサイズが小さいため、手順はscBATの処理に特化して変更され、最適化されています。これらの変更の中には、組織採取中に解剖顕微鏡を使用して、凍結scBATサンプルの精度と均質化を高め、その後のqPCR分析の効率を高めることが含まれます。これらの最適化により、マウスにおけるscBATの同定、形態学的外観、および分子特性を決定することができます。

概要

米国および世界中で肥満の有病率が増加していることから、肥満の病因を理解し、潜在的な治療法を特定することに大きな関心が寄せられています^1,2。脂肪組織は代謝に重要な役割を果たしており、脂肪組織の調節不全は肥満の発症につながる可能性があります。一般的に、脂肪組織には白色脂肪組織と褐色脂肪組織の2種類があります。白色脂肪組織(WAT)は化学エネルギーを蓄え、内分泌因子を分泌することができますが、褐色脂肪組織(BAT)は化学エネルギーを使用して熱を発生させ、寒さの中で体温を維持することができます^3,4。このユニークな能力により、BATの活性化はエネルギー消費を増加させ、インスリン感受性を改善することもできます⁵。

BATは、タンパク質1(UCP1)⁶の脱共役によって媒介される非震え熱発生を介してその機能を発揮します。マウスやヒトを含む哺乳類は、さまざまな量のBATを保有しています。BATの古典的な見解は、これらの脂肪組織は成人のヒトよりもマウスや乳児に豊富に存在するというものです。肩甲骨の間の背側上部に位置するiBATは、マウスで最も研究されているBATデポ....

プロトコル

動物の処置は、ベイラー医科大学の動物管理および使用委員会によって承認されました。すべての手順は、生後3週間と3か月のC57BL / 6J雄マウスで実施されました。解剖に先立ち、すべてのマウスは、承認されたげっ歯類の二酸化炭素安楽死手順を使用して安楽死させました。このプロトコルで使用されるすべての材料、試薬、および機器に関連する詳細については、材料表を参照してください。

1. scBATの解剖

1. マウスの死骸を作業台に置き、手術用ハサミと極細点鉗子を70%エタノールで洗浄します。
2. マウスの腹頸部に70%エタノールをスプレーして毛皮を濡らし、毛皮の汚染を最小限に抑えます。
3. 鎖骨に沿って約1.5cmの両側切開を行います。
4. 前の切開の端から、耳に向かって縦方向に約1 cmの長さに切ります。これにより、首の周りに四角いU字型の切開が形成されます(図1A、B)。
   注:scBATは首の中間層にあります。皮膚、皮下脂肪組織、唾液腺で構成される表層は、このステップ中に露出します。中間層には、scBATとともに、頸静脈と頸部の筋肉が含まれています。頸部の深部BATと動脈・頸静脈を含む頸部の深層は、骨格筋を切除することで露出します。
5. マウスを解剖顕微鏡の下に置き、露出し....

ディスカッション

このプロトコルでは、H&Eおよび遺伝子発現解析のためのscBATの解剖および処理手順を詳細に示します。scBATは頸部の中間層にあり、太い静脈に沿っているため、このデポの分離には正確な技術が必要です。具体的には、デポをはっきりと見るために、首を開いた後にマウスを解剖顕微鏡の下に置くことをお勧めします。一対の極細点鉗子を使用して、唾液腺と周囲の静脈からscBATを剥がし、静?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
95% Dehydrant Alcohol (Flex 95)	Epredia	8201
100% Dehydrant Alcohol (Flex 100)	Epredia	8101
96-well PCR plate	Bio-Rad	MLL9601
Aurum Binding Mini Column	Bio-Rad	7326826
Aurum High Stringency Wash	Bio-Rad	7326803
Aurum Low Stringency Wash	Bio-Rad	7326804
Base Molds (for embedding)	Tissue-Tek	4122
BD PrecisionGlide Needle 21g x 1 1/2"	Becton Dickinson	305167
C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad	1840148
Capless Microcentrifuge Tubes 2 mL	Fisherbrand	02-681-453
Centrifuge	Eppendorf	5430R
CFX Opus 96 Real-Time PCR Instrument	Bio-Rad	12011319
Chloroform	Thermo Scientific Chemicals	383760010
Cytoseal 60 Low-viscosity mounting medium	Epredia	83104
DEPC-Treated Water	Ambion	AM 9906
Dissecting Microscope	Nikon	SMZ1500
DNase Dilution Solution	Bio-Rad	7326805
DNase I	Bio-Rad	7326828
dNTPs	Invitrogen	18427013
Elution solution	Bio-Rad	7326801
EM 400 embedding medium paraffin	Leica Biosystems	3801320
Eosin Y (0.5% w/v)	RICCA	2858-16
Formula R Infiltration medium paraffin	Leica Biosystems	3801470
Genemark Nutator Gyromixer 349	Bio Express	S-3200-2
Gill #3 Hematoxylin	Sigma-Aldrich	GHS332-1L
HCl (for HCL-Ethanol)	Fisher Chemical	A142212
IP VI Embedding Cassettes	Leica Biosystems	39LC-550-5-L
Koptec's Pure Ethanol - 200 Proof (for 70% Ethanol)	Decon Labs	V1001
MgCl2 (25 mM)	Thermo Fisher Scientific	R0971
Microcentrifuge Tubes 1.7 mL	Avantor	87003-294
Microseal 'B' Seals (adhseive seals)	Bio-Rad	MSB1001
Microtome	Leica Biosystems	RM2245
Molecular Biology Grade Water	Corning	46-000-CM
Mortar Coors Tek	Thomas Scientific	60310
NaCl (for 0.85% saline)	Fisher Bioreagents	BP358-212
NanoDrop Spectrophotometer	NanoDrop Technologies	ND-1000 UV/Vis
Oligo dT	Invitrogen	18418020
Paraffin Section Flotation Bath	Boekel Scientific	14792V
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	P6148-500G
PCR Tube Strip	Avantor	76318-802
Pestle by Coors Tek	Thomas Scientific	60311
Pestle Pellet Motor	Kimble	749540-0000
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
Precision Model 19 Vacuum Oven	Thermo Fisher Scientific	CAT# 51221162
Primer: 36B4  (forward) 10 μM 5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3’			Chen lab Oligo database
Primer: 36B4 (reverse) 10 μM 5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGG AGT GT 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Fabp4 (forward) 10 μM 5’ ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Fabp4 (reverse) 10 μM 5’ CCA TCT AGG GTT ATG ATG CTC TTC A 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Glut 4 (forward primer) 10 μM 5’ CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Glut 4 (reverse) 10 μM 5’ GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3’			Chen lab Oligo database
Primer: PPARg (forward) 10 μM 5’ AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3’			Chen lab Oligo database
Primer: PPARg (reserve) 10 μM 5’ AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Ppargc1a (reverse) 10 μM 5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Ppargc1a(forward) 10 μM 5' ACG TCC CTG CTC AGA GCT TCT CA 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Ucp1 (forward) 10 μM 5’ AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Ucp1 (reverse) 10 μM 5’ ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3’			Chen lab Oligo database
RNA isolation solution (PureZol)	Bio-Rad	7326880
RNase Away (surface decontaminant)	Thermo Scientific	1437535
RNase H	NEB	M0297S
Rnase inhibitor (RNase Out)	Invitrogen	10777019
Scintillation Vial (glass)	Electron Microscopy Sciences	72632
Slide drying bench	Electrothermal (Cole-Parmer)	MH6616
Stainless staining rack	Electron Microscopy Sciences	70312-54
Stereo microscope (for embedding)	Olympus	SZ51
Sugical scissors	McKesson	43-1-104
Superfine point Straight Dissecting Forceps	Avantor	82027-402
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Superscript III Reverse Transcriptase (Includes 5x First-Strand Buffer and 0.1M DTT)	Invitrogen	18080044
SUR-VET syringe with needle 25 G x 5/8", 1 mL	Terumo	100281
SYBR Green (qPCR enzyme master mixture)	Applied Biosystems	A25778
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set (jars)	Electron Microscopy Sciences	SKU: 62540-01
Toluene	Fisher Chemical	T324-1
Transfer pipette	Avantor	414004-005
Xylene	Fisher Chemical	X3P-1GAL