凍結保存されたIn Vitro由来血液細胞からの核分離

要約

凍結保存された人工多能性幹細胞由来の間質/内皮および血液細胞タイプから高品質の核を抽出するためのプロトコルについて説明し、単一核の次世代シーケンシング解析をサポートします。高品質で無傷の原子核を作製することは、マルチオミクス実験にとって不可欠ですが、研究室によってはこの分野への参入障壁となることがあります。

要約

人工多能性幹細胞(iPSC)ベースのモデルは、血液の発生を理解するための優れたプラットフォームであり、iPS細胞由来の血液細胞は、臨床検査試薬や輸血可能な細胞治療薬としてトランスレーショナル有用性があります。一核RNAシーケンシング(snRNAseq)やトランスポザーゼアクセス可能クロマチンシーケンシングアッセイ(snATACseq)を含むがこれらに限定されないマルチオミクス解析の出現と拡大は、細胞発生の理解に革命をもたらす可能性を提供します。これには、 in vitro 造血モデルを用いた発生生物学が含まれます。しかし、培養細胞や初代細胞から無傷の核を単離することは技術的に困難な場合があります。細胞の種類が異なれば、細胞の硬直性や含有量に応じて、しばしば調整された核調製が必要になります。このような技術的な困難は、データの品質を制限し、マルチオミクス研究に関心のある研究者にとって障壁となる可能性があります。細胞の収集や処理には制限があるため、試料の凍結保存が必要になることが多く、凍結したサンプルは無傷の核分離にさらなる技術的課題をもたらす可能性があります。この論文では、 in vitro 造血のさまざまな段階でiPS細胞由来細胞から高品質の核を単離し、単一核マルチオミクスワークフローで使用するための詳細な方法を提供します。私たちは、iPS細胞由来の接着性間質/内皮細胞と非接着性造血前駆細胞からの核の単離にメソッド開発の焦点を当ててきました。これらは構造的および細胞同一性に関して非常に異なる細胞タイプを表しています。説明したトラブルシューティング手順により、核の凝集とデブリが最小限に抑えられ、下流の分析に十分な量と質で原子核を回収することができました。同様の方法は、他の凍結保存された細胞タイプから核を単離するために適応され得る。

概要

造血は比較的よく特徴付けられた発生システムですが、in vitroで血球形成を再現できないことは、関連因子の理解が不完全であることを示しています。人工多能性幹細胞(iPSC)ベースの造血モデルは、主要な発生因子と関連する生物学の解明に役立ちます。また、iPSCシステムは血液疾患の研究にも優れたモデルを提供しており、iPS細胞ベースの血液細胞は、翻訳および治療に関連のある試薬^1,2,3,4を産生するために開発されています。シングルセル研究は、造血中に産生される細胞タイプを含む、iPS細胞ベースの発生生物学の研究に広く利用されています⁵。細胞亜集団間の関係を推測できないバルクRNAシーケンシング⁶と比較して、シングルセルモダリティは細胞の不均一性の評価を可能にし、細胞発生の同定と特性評価を容易にする^{ことができる6,7}。

iPS細胞から造血細胞を形成するには、原始線条、中胚葉、内皮状態を経て逐次分化し....

プロトコル

1. 細胞の凍結保存

1. 1 mLあたり>1 x 10⁶ 個の単離されたiPS細胞を、90%FBSおよび10%DMSOの1 mLで凍結します。クライオバイアルを-80°Cの凍結容器に入れて、凍結速度を下げ、生細胞の回収を最適化します(材料表)。かなりの細胞損失が予想されますが、これは培養条件や細胞の同一性によって異なります。
2. -80°Cから24時間以内に液体窒素貯蔵に移動します。

2. 細胞の解凍

1. 液体窒素貯蔵庫からクライオバイアルを取り出し、37°Cのウォーターバスで2分間解凍します。小さな氷の結晶がまだ見えるうちに水浴から取り出します。
2. 細胞をクライオバイアルから空の15 mLチューブに移し、予熱した培地10 mL(RPMI 1640 + 10% FBS)を慎重に混合しながらゆっくりと加えます。400 x g で25°Cで3分間遠心分離します。
3. 上清を吸引し、2% FBS と 1 mM CaCl₂ を添加した 1 mL の DPBS に再構成します (材料表)。1000 μLのマイクロピペットで3回ピペッティングして慎重に混合します。5mLのポリスチレン丸底チューブに移し....

ディスカッション

プロトコル内の重要なステップ
急速に進化している現在の単一核ベースの次世代シーケンシングモダリティを成功裏に実装するためには、高品質の核を単離することが不可欠です。これらのアプローチ、特に凍結保存された標本に関心のある研究室には既存の障壁があることを認識し、私たちは以前に凍結した細胞に合わせた核分離技術を作成するつもりでした。凍結保存さ?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Culture Reagents
Dimethyl sulfoxide solution (DMSO)	Sigma	673439
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	Corning	21031CV
Fetal Bovine Serum (FBS)	GeminiBio	100106
RPMI Medium 1640 (1X)	Gibco	11875093
Cells
Induced pluripotent stem cells	N/A	N/A	The iPSCs used in this study were obtained through the CHOP Human Pluripotent Stem Cell Core Facility
Cell Staining Reagents
Trypan Blue Solution	Corning	25900CI
Dead Cell Removal Reagents
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma	C4901
EasySep Dead Cell Removal (Annexin V) Kit	StemCell Technologies	17899	This kit is designed for the depletion of unwanted cell types labeled with biotin. The kit includes Dead Cell Removal (Annexin V) Cocktail, Biotin Selection Cocktail, and Dextran beads. This kit targets phosphatidylserine on the outer leaflet of the cell membrane of apoptotic cells using Annexin V. Unwanted cells are labeled with Annexin V, Biotinylated antibodies, and magnetic particles, and separated without columns using an EasySep magnet. Desired cells are simply poured off into a new tube.
Materials
10 µl Micropipette	Wards science	470231606
100 µl Micropipette	Wards science	470231598
1000 µl Extended Universal Tip	Oxford Lab Products	OAR-1000XL-SLF
1000 µl Micropipette	Wards science	470231602
2.0 ml Cryogenic vials	Corning	431386
20 µl Micropipette	Wards science	470231608
200 µl Micropipette	Wards science	470231600
5ml Polystyrene Round-Bottom Tube	Falcon	352063
Corning DeckWork 0.1-10 µl Pipet Tip Station	Corning	4143
Corning DeckWork 1-200 µl Pipet Tip Station	Corning	4144
Counting chamber	CytoSMART	699910591
Flowmi Cell Strainer, 40 µm	Bel-Art	H136800040
Magnet	StemCell Technologies	18000
NALGENE Cryo 1°C Freezing Container	Nalgene	51000001
Nuclei Isolation Reagents			Nuclei isolation reagents include Lysis Buffer,  Wash buffer, and Diluted Nuclei Buffer,and Lysis Dilution Buffer. The constitution of these buffers are in the Table 1, 2, and 3. Our nuclei isolation method improved isolation from the standard kit protocols (e.g., 10x Genomics Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide [CG000338]). This protocol can be used with several commercial kits, including the Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 16 rxns (PN-1000283).
Dead Cell Removal kit	STEMCELL	17899
Digitonin	Thermo Fisher Scientific	BN2006
DL-Dithiothreitol solution (DTT)	Sigma	646563
Flowmi Cell Strainer, 40 µm	Bel-Art	H136800040
MACS bovine serum albumin (BSA) stock Solution	Miltenyi Biotec	130091376
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma	7786303
Magnesium Chloride Solution, 1 M	Sigma	M1028
Nonidet P40 Substitute	Sigma	74385
Nuclease-Free Water	Thermo Fisher Scientific	AM9937
Nuclei Buffer (20X)	10X Genomics	2000153
Protector RNase inhibitor	Sigma	3335399001
Sodium chloride (NaCl)	Sigma	S7653-250G
Sodium Chloride Solution, 5 M	Sigma	59222C
Trizma Hydrochloride Soultion, pH 7.4	Sigma	T2194
Trizma hydrochloride (Tris-HCl) (pH7.4)	Sigma	T3252-500G
Tween 20	Bio-Rad	1662404
Other equipment
Automated cell counter	CytoSMART	699910591
Microscope	Zeiss	Primostar 3