成体ゼブラフィッシュにおける腹腔内注射技術により、体の損傷とそれに伴う死亡を最小限に抑える

要約

成体ゼブラフィッシュにおける新しい腹腔内(IP)注射法について記載する。ドキソルビシンなどの有毒化合物を取り扱う場合、この手順は以前に報告された2つのIPメソッドよりも効果的です。この手法は、ゼブラフィッシュモデルの経験が限られている研究者が簡単に採用できるように設計されています。

要約

遺伝的にアクセス可能な成魚のゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、心筋症などのヒトの疾患を研究するための貴重な脊椎動物モデルとして採用されています。腹腔内(IP)注射は、治療効果の試験やドキソルビシン誘発性心筋症(DIC)などの疾患モデルの生成のために、化合物を体内に送達する重要な方法です。現在、IPインジェクションには2つの方法があります。どちらの方法も、ドキソルビシンなどの有毒化合物の取り扱いには制限があり、体型に深刻な損傷を与えたり、魚を死に至らしめたりする副作用が現れます。これらの欠点は、広範な研究者のトレーニングによって克服できますが、副作用が最小限の新しいIP注入方法が望ましいです。ここでは、毒性化合物を扱える独自のIP注入方法について報告します。心機能が一貫して低下すると、魚の死を招くことなく結果を得ることができます。この技術は、ゼブラフィッシュの成魚の経験がほとんどない研究者でも簡単に習得できます。

概要

ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、ヒトとの高い遺伝子・臓器相同性、体外受精、遺伝子操作の容易さ、早期成熟期の体内透明性など、ヒトの疾患研究の実験モデルとして注目されています¹。ゼブラフィッシュの胚や幼虫のために直接水に薬を投与する単純なプロセスとは異なり、成体のゼブラフィッシュに薬を投与することは、より複雑で困難な試みを提示します²。

成魚では、化合物は、水中への直接投与などの受動的な薬物送達技術、または強制2のような経口薬物送達方法によって送達^{することができる。}他のアプローチには、魚介類を化合物でコーティングし、続いて魚に給餌^{すること3}、および眼窩後または腹腔内注射^4,5を含む、所定の濃度での水不溶性薬物の直接投与が含まれる。腹腔内投与は、その明確な薬物動態学的利点により、疾患モデルのin vivo研究に好まれます⁶。この方法は、高い薬物濃度と腹腔内の長い半減期を提供し、^薬物送達のための効果的な経路を提供する^7,8

プロトコル

実施されたすべての手順は、メイヨークリニックの施設内動物管理および使用委員会によって承認され、「実験動物のケアと使用に関するガイド」(National Academies Press、2011年)に概説されている基準に準拠していました。この研究に参加したすべてのゼブラフィッシュは、野生インド核型(WIK)株に属しています。本試験に使用した試薬および機器の詳細は、 資料表に記載されています。

1.ドキソルビシン原液の調製と保管

1. ドキソルビシンストックは市販の供給元から入手してください。
   注:ドキソルビシンは光感受性があるため、粉末状にして入手し、不透明な容器に保管して光への曝露から保護します。薬品フード内でDox粉末調製のすべての手順を実行します。
2. Dox粉末を蒸留水に完全に溶解し、最終濃度5 mg / mLのストック溶液を調製します。
3. ストックを1.5mLのチューブに分割して分注します。
4. チューブをアルミホイルで包み、光にさらされないように保護します。
5. アリコートDox溶液は、短期保存(<1か月)の場合は4°Cで、長期保存の場合は-20°Cで保存します¹⁰。

2.魚を体重に応じて....

ディスカッション

新しいIPインジェクション方法は、既存の2つのIPインジェクション方法^4,10とは異なり、以下の明確な特徴によって特徴付けられる。まず、独自の針貫通角度が使用されます(ゼロに近い)。第二に、針は、ユニークな場所、すなわち、魚の腹側表面の自然な穴を介して魚を貫通し、これにより注入が容易になります。そして最後に、針の動きは.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 μL NanoFil-syringe	World Precision Instruments, Inc	NANOFIL	injection tool
34 G needle	World Precision Instruments, Inc	NI34BV-2	injcetion tool
60 mm Petri dish	fisher scientific/fisherbrand	FB0875713A	placing the sponge
Dissecting microscope	Nikon	SMZ800	Injceting the Dox
Doxorubicin hydrochloride	Sigma	D1515-10MG	drug for creating DIC model
Echocardiography	VISUAL SONICS	Vevo 3100	measuring cardiac function
Foam Sponge	Jaece Industries	L800-D	placing the fish
Hank's balanced salt solution (HBBS)	Thermo Fisher	14025076	Vehicle for Dox
Microcentrifuge	southernlabware	MyFuge/C1012	collect the Dox solution
Precision Balance Scale	Torbal	AD60	Digital scales
Tricaine	Argent	MS-222	Anesthetizing fish
Tube	Eppendorf	1.5 mL	storage
vevo LAB  software	FUJIFILM VISUAL SONICS	5.6.0	quantification of the heart