Fast Protein Liquid Chromatographyシステムを用いた6X-Hisタグ付きタンパク質のアフィニティー精製(英語)

要約

この記事では、6X-ヒスチジンタグで標識されたヒト組換えタンパク質であるフラップエンドヌクレアーゼ1(FEN1)のアフィニティー精製の手順について説明します。このプロトコルでは、タグ付きタンパク質の精製に2つの異なる固定化金属イオンカラムを使用します。

要約

タンパク質の機能特性評価には、生化学的アッセイを行うために、タンパク質を高純度で大量に発現および精製する必要があります。高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)システムにより、複雑なタンパク質混合物を高分解能で分離できます。FPLCでは、適切な精製マトリックスの選定、タンパク質サンプルの温度制御、マトリックスへのサンプルの流量や溶出速度の管理など、さまざまなパラメータを調整することで、タンパク質の安定性と機能性を確保することができます。このプロトコールでは、細菌培養で産生された6X-Hisタグ付きフラップエンドヌクレアーゼ1(FEN1)タンパク質を精製するためのFPLCシステムの汎用性を実証します。タンパク質精製効率を向上させるために、適切なカラムの充填と調製、サンプルループを使用したサンプル注入、カラムへのサンプル適用の流速、サンプル溶出パラメータなど、複数の考慮事項に焦点を当てます。最後に、クロマトグラムを分析して、高収率のタンパク質を含む画分を特定し、適切な組換えタンパク質の長期保存に関する考慮事項を特定します。タンパク質精製法の最適化は、タンパク質分析の精度と信頼性を向上させるために重要です。

概要

細胞生物学を理解するためには、数多くの戦略が考えられます。1つのアプローチには、遺伝子変異を遺伝子に導入し、その後、モデル生物に結果として生じる表現型の変化を評価するトップダウン戦略が含まれます。逆に、還元主義的アプローチでは、特定のタンパク質の分子メカニズムと酵素機能の最初の解明を伴い、他の細胞成分との相互作用の特性評価を伴います。その後、このタンパク質が生物学的経路に与える影響が評価されます。それぞれの研究アプローチには固有の利点と限界がありますが、生物学的経路を包括的に理解するには、学際的な研究が必要です。

DNAは生命の遺伝的設計図であり、DNA複製とゲノム維持のメカニズムを理解することは、70年以上にわたって活発な関心が寄せられてきた分野です。DNA複製の分野における研究は、多数の複製タンパク質の個々の構造と機能に関する豊富なデータを生み出しています。これらの調査は、機構的側面と生化学的活性アッセイを包含しており、これらのタンパク質の精製を通じて実現可能になり、 in vitro 環境での綿密な検査が可能になりました。その結果、タンパク質の精製は、DNA複製のメカニズムの洞察を解明することを目的とした研究の大部分において、不可欠でユビキタスな技術として浮上しています。

この記事では、細菌細胞で過剰発現している6X-ヒスチジンで....

プロトコル

1. サンプル調製

1. 組換えFEN1を精製するには、Ononyeらによって以前に報告されたように、BL21(DE3)細胞でコンストラクト(pET-FCH-FEN1)を発現します.⁸。
   1. LB培地(表1)に1%一晩培養液を接種し、ODが0.6に達するまで細胞を37°Cで増殖させます。
   2. 0.4 Mイソプロピル-β-D-チオガラクトシド(IPTG)で誘導し、さらに3時間培養します。
   3. 培養物を5,000 × g で4°Cで15分間遠心分離することにより、細胞を回収します。 ペレットを-80°Cの冷凍庫に保管します。
   4. 精製当日に、細胞ペレットを-80°Cの冷凍庫から取り出し、氷上で解凍した後、ペレットを100 mLの溶解緩衝液に再懸濁します(表1)。
      注:細胞溶解物は、タンパク質分解を防ぐために、取り扱い中は常に氷の上に置く必要があります。解凍後、すべての精製プロセスを同じ日に完了する必要があります。細胞溶解物は冷蔵庫に一晩保存しないでください。
2. 懸濁液を250mLビーカーに移し、30秒オンおよび30秒オフで35%の振幅で15分間氷上で超音波処理します。
   注意....

ディスカッション

アフィニティークロマトグラフィーは、DNA結合タンパク質を精製するために広く使用されている手法です。固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)は、金属イオンを使用してペプチド配列のヒスチジン残基を捕捉する特定のタイプのアフィニティークロマトグラフィーです。そのため、精製するタンパク質のN末端やC末端に「6X-Hisタグ」や「poly-Hisタグ」?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4x Laemmli sample buffer	BioRad	1610747
Acetic acid	Merck	UN2789
Beta-mercaptoethanol (BME)	Sigma	M-6250
Chromlab software version 6.1.27.0	BioRad		operates the NGC system
Complete MINI protease inhibitor tablet	Roche	11836153001
Coomassie Brilliant Blue R	Sigma	B0149
Dithiothreitol (DTT)	Dot Scientific	DSD11000
Econo-Column glass	BioRad	7371512
Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA)	Dot Scientific	DSE57020
Flow adaptor	BioRad	7380014
Glycerol	Dot Scientific	DSG22020
Imidazole	Dot Scientific	DSI52000
Methanol	Fisher Scientific	A412
Mini PROTEAN TGX gels	BioRad	4561084
NGC Chromatography System	BioRad		automated liquid chromatography system
Ni-NTA Agarose	Qiagen	1018244
Phenyl-methyl-sulfonyl fluoride	Dot Scientific	DSP20270
PreScission Plus Protein Dual Color Standards	BioRad	1610374
Sodium chloride	Dot Scientific	DSS23020
TALON metal affinity resin	Takara	635502
Tris Base		DST60040