フィブリノーゲン-ポリアクリルアミドゲル電気泳動による Sipunculus nudus における活性フィブリノゲン分解剤の迅速な分離と表示

要約

ここでは、 Sipunculus nudusのフィブリノゲン分解剤を迅速に分離して表示するためのフィブリノーゲン-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)プロトコルを紹介します。

要約

フィブリノーゲンを直接溶解できるフィブリノゲン溶解剤は、抗凝固治療に広く用いられてきました。一般に、新しいフィブリノジェノジェノリシス剤を同定するには、まず各成分を分離し、次にそれらのフィブリノジェノジェノリシス活性を確認する必要があります。現在、分離段階ではポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)とクロマトグラフィーが主に使用されています。一方、PAGEに基づくフィブリノーゲンプレートアッセイおよび反応生成物は、通常、それらのフィブリノジェノ溶解活性を表示するために採用されます。しかし、これら2つのステージは時空間的に分離しているため、同じゲルで活性なフィブリノゲン分解剤を分離して表示することは不可能です。フィブリノジェノジェノリシス剤の同定の分離と表示プロセスを簡素化するために、本研究では、ピーナッツワーム(Sipunculus nudus)のフィブリノゲンゲン剤を迅速に分離して表示するための新しいフィブリノーゲン-PAGE法を構築しました。この方法には、フィブリノーゲン-PAGE調製、電気泳動、再生、インキュベーション、染色、および脱色が含まれます。タンパク質のフィブリノゲン分解活性と分子量を同時に検出できます。この方法によれば、6時間以内にピーナッツワームホモジネートの複数の活性フィブリンゲン分解剤を検出することに成功しました。さらに、このフィブリノーゲン-PAGE法は、時間とコストにやさしいです。さらに、この方法は、他の生物のフィブリンゲン分解剤の研究にも使用できます。

概要

近年、血栓性疾患の増加が続いているため、血栓性疾患は新たな主要な世界的な健康問題となっています¹。現在、抗血栓薬は、抗血小板凝集薬、抗凝固薬、血栓溶解薬の3つに分類されています。その中で、ウロキナーゼ(英国)、組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)などの血栓溶解薬は、血栓²を加水分解できる唯一の臨床的に使用されている薬です。一方、新規の血栓溶解薬の同定により、より安全で効果的な血栓溶解薬が開発されています³。

しかし、新規血栓溶解剤の同定には、主に分離/精製、特性評価/チェックの段階が含まれ、時間と労力がかかります。前者は各成分を分離することであり、後者はそれらのフィブリノ(ジェノ)分解活性を示す^{ことである4,5}。これまでの研究では、アフィニティークロマトグラフィーとフィブリン(ogen)プレートアッセイ^6,7,8により、ピーナッツワーム(Sipunculu....

プロトコル

1.ピーナッツワームホモジネートの準備

1. 50 gのピーナッツワームと150 mLの生理食塩水をホモジナイザーに加えます。
2. 24000rpmで60秒間均質化します。
   注意: 3回繰り返します。
3. ホモジネートを9710 x g で4°Cで30分間遠心分離します。
4. さらなる研究のために、上清をピーナッツワームホモジネートとして収集します。

2. Fibrinogen-PAGEゲル調製

1. 0.01 gのフィブリノーゲンを50 mLのガラスビーカーに秤量します。
2. 1.9 mLのDDH₂O、1.3 mLのTris-HCl(1.5 M、pH 8.8)、および0.05 mLのSDS(10%、w / v)をビーカーに加えます。ピペッティングでよく混ぜます。
3. ビーカーを37°Cに30分間置きます。
   注:このステップは、フィブリノーゲンを溶解することです。
4. アクリルアミド1.7 mL(30%、w / v)、過硫酸アンモニウム0.05 mL(APS;10%、w / v)、TEMED0.002 mLを追加します。ピペッティングでよく混ぜます。
   ....

ディスカッション

sFEは^{、私たちのチームが}以前に^3,6,8,13でピーナッツワームから単離した新しいフィブリノ(遺伝子)溶解酵素です。しかし、sFEの同定プロセスには、フィブリノジェノ溶解活性の検出、タンパク質成分の分離、活性確認の段階など、時間と労力がかかりました。簡単な方法?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1  M Tris-HCl (pH 6.8)	Solarbio	T1020
1.5 M Tris-HCl (pH 8.8)	Solarbio	T1010
30% Acrylamide/Bis-acrylamide	Biosharp	BL513B
Ammonium persulfate	XiLONG SCIENTIFIC	7727-54-0
Beaker	PYREX	2-9425-02
Centrifuge Tube (1.5 mL)	Biosharp	BS-15-M
Constant Temperature Incubator	JINGHONG	JHS-400
Coomas Brillant Blue Stainning solution	Beyotime	P0017F
Electronic Analytical Balance	DENVER	TP-213
Fibrinogen	Solarbio	F8051
Gel loading pipette tips, Bulk	Biosharp	BS-200-GTB
Homogenizer	AHS	ATS-1500
Horizontal rotation oscillator	NuoMi	NMSP-600
Milli-Q Reference	Millipore	Z00QSV0CN
Mini-PROTEAN Tetra Cell	BIO-RAD	165-8000~165-8007
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine	Sigma	T9281
Pipette Tip (1 mL)	Axygene	T-1000XT-C
Pipette Tip (10 µL)	Axygene	T-10XT-C
Pipette Tip (200 µL)	Axygene	T-200XT-C
Pipettor (1 mL)	Thermo Fisher Scientific	ZY18723
Pipettor (10µL)	Thermo Fisher Scientific	ZX98775
Pipettor (200 µL)	Thermo Fisher Scientific	ZY20280
Pipettor (50 µL)	Thermo Fisher Scientific	ZY15331
Refrigerated Centrifuge	cence	H1650R
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	V900859
Tris	Solarbio	T8060
Tris-HCl	Solarbio	T8230
Triton X-100	Solarbio	T8200