13名LC-MSに関連するC6-グルコース標識:二次代謝物合成における植物一次器官の同定

要約

液体クロマトグラフィー高分解能質量分析と組み合わせた ¹³C₆-グルコース標識の開発された方法は汎用性が高く、薬用植物における二次代謝産物の合成に関与する主要な臓器と経路、およびこれらの二次代謝産物の包括的な利用に関する将来の研究の基礎を築きます。

要約

この論文は、二次代謝物合成に関与する一次臓器を認証するための新しく効率的な方法を提示します。Parispolyphylla var. yunnanensis(Franch.)の最も重要な二次代謝物として手。-Mzt.(PPY)、パリサポニン(PS)はさまざまな薬理活性を持ち、PPYの需要が高まっています。この研究では、葉、根茎、および幹-血管束 ¹³C₆-グルコース摂食および非摂食の 4 つの治療法を確立し、パリサポニン VII (PS VII) 合成に関与する主要な臓器を正確に認定しました。液体クロマトグラフィー-質量分析(LC-MS)を組み合わせることにより、さまざまな処理における葉、根茎、茎、根の¹³C/¹²C比を迅速かつ正確に計算し、(M+1)^-/M^-、(M+2)^-/M^-、(M+3)^-/M^-、(M+4)^-/M⁻の4種類のPS同位体イオンピーク(M^-)比を見つけました。その結果、茎-血管束と根茎の摂食処理の根茎の¹³C/¹²Cの比率は、非摂食治療のそれよりも有意に高いことが示されました。非摂食処理と比較して、葉中のPS VII分子(M + 2)^-/ M^-の比率は、葉および茎-血管束の供給処理の下で有意に増加しました。同時に、非摂食処理と比較して、根茎処理中の葉のPS VII分子(M + 2)^-/ M⁻の比率は有意差を示さなかった。さらに、茎、根、根茎のPS VII分子(M + 2)^-/M⁻の比率は、4つの処理間で差を示さなかった。非摂食処理と比較して、葉の供給処理を受けた葉のパリサポニンII(PS II)分子(M+2)^-/M⁻の比率は有意差を示さず、PS II分子のPS II分子の(M+3)⁻/M⁻の比率は低かった。このデータにより、PS VIIの合成の主要な器官は葉であることが確認されました。これは、薬用植物における二次代謝産物の合成に関与する主要な器官と経路の将来の同定の基礎を築きます。

概要

植物における二次代謝産物の生合成経路は複雑で多様であり、非常に特異的で多様な蓄積器官が関与しています¹。現在、多くの薬用植物における二次代謝産物の特異的な合成部位と責任のある器官は明確に定義されていません。この曖昧さは、医薬品の収量と品質の両方を最適化するように設計された栽培方法の戦略的な進歩と実施に大きな障害をもたらします。

分子生物学、生化学的、および同位体標識技術は、薬用植物^2,3,4,5の二次代謝産物の合成経路と部位を解明するために広く採用されており、これらの方法論のそれぞれは、効率や精度の違いなど、独自の長所と限界を示しています。例えば、分子生物学的アプローチは、生合成経路内の部位を高い精度で特定することができますが、特に時間がかかります。その有用性は、一般に利用可能なゲノム配列を持たない種にとってさらに制約され、これらの技術はそのような場合には実行可能性が低くなる⁶。対照的に、³C/¹²C、²H/

プロトコル

1. 実験の準備

1. 植物の成長中、温室の相対湿度が75%、昼/夜の温度が20°C / 10°C、日長が昼12時間と夜12時間で構成され、光強度が100μmol・^m-2・^s-1であることを確認してください。発光ダイオード(LED)ランプを介して放射照度を提供し、LEDランプと植物のキャノピーとの間に30cmの距離を保ちます。
   注:日長と光の強度は、雲南省の成長期間中の日照時間数によるものです。放射照度は、量子センサーによって日常的に測定されます( 材料の表を参照)。薬用植物の特性に応じて、環境パラメータに必要な変更を加えます。これらの環境条件が植物の特性と地域の日光プロファイルに基づいて慎重に較正されたら、実験期間中、これらの環境で一貫性を維持することが重要です。環境パラメータを最初に確立した後に任意に変更を加えると、実験の完全性と結果の信頼性が損なわれる可能性があります。
2. 水耕栽培アプローチ¹⁸を使用して、実験の精度と特異性を確保します。洗浄した2年前のPPY苗(雲南省文山(東経104度11分、北緯23度04分)から収穫)を^1/₄標準濃度のホーグランドの栄養溶液に3日間浸して適応させてください。
   1. 指示に従って、ホーグランドの栄養素( 材料の表

ディスカッション

このプロトコルを成功裏に実施できるかどうかは、植物の生理学的特性、組織、器官、および二次代謝産物に関する包括的な研究にかかっています。このプロトコルで概説されている実験デザインアプローチは、植物の二次代謝産物の生合成経路を調査するための強固な基盤を築きます。この実験で重要なのは、(1)多年生の苗の年齢を決定すること、(2)正しい同位体標識検出タイミングを選?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 % Formic acid water	Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory	44890
13C6-Glucose powder	MERCK	110187-42-3
Acetonitrile	Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory	44890
AUTOSAMPLER VIALS	Biosharp Biotechnology Company	44866
BEH C18 column	Waters,Milfor,MA	1.7μm,2.1*100 mm
CNC ultrasonic cleaner	Kunshan Ultrasound Instrument Co., Ltd	KQ-600DE
Compound DiscovererTM  software	Thermo Scientific, Fremont,CA	3
Compound DiscovererTM  software	Thermo Scientific,Fremont,CA	3
Electric constant temperature blast drying oven		DHG-9146A
Electronic analytical balance	Sedolis Scientific Instruments Beijing Co., Ltd	SOP
Ethanol	Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory	44955
Fully automatic sample rapid grinder	Shanghai Jingxin Technology	Tissuelyser-48
Gas Chromatography-Stable Isotope Ratio Mass Spectrometer	Thermo Fisher	Delta V Advantage
Hoagland solution	Sigma-Aldrich	H2295-1L
Hydroponic tank	JRD	1020421
Isodat software	Thermo Fisher Scientific	3
Liquid chromatography high-resolution mass spectrometry	Agilent Technology	Agilent 1260 -6120
Nitrogen manufacturing instrument	PEAK SCIENTIFIC	Genius SQ 24
Organic phase filter	Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd	44890
Oxygen pump	Magic Dragon	MFL
Quantum sensor	Highpoint	UPRtek
Scalpel	Handskit	11-23
Sprinkling can	CHUSHI	WJ-001
Xcalibur  software	Thermo Fisher Scientific	4.2