体積電子顕微鏡法のための網膜サンプルの調製

要約

このプロトコルでは、網膜光受容体末の構造的特徴に焦点を当てて、体積電子顕微鏡用の網膜サンプルを調製するための詳細な手順について説明します。

要約

体積電子顕微鏡(Volume EM)は、細胞や組織の3D構造をナノメートルレベルの精度で視覚化するための強力なツールとして登場しました。網膜内では、さまざまな種類のニューロンが内叢状層と外叢状層にシナプス接続を確立しています。従来のEM技術は、網膜細胞内小器官に関する貴重な洞察をもたらしてきましたが、その限界は2D画像データの提供にあり、正確な測定を妨げる可能性があります。例えば、シナプス伝達に不可欠な3つの異なるシナプス小胞プールのサイズを定量化することは、2Dでは困難です。Volume EMは、大規模で高解像度の3Dデータを提供することでソリューションを提供します。サンプル調製はボリュームEMの重要なステップであり、画像の鮮明度とコントラストに大きな影響を与えることは注目に値します。これに関連して、網膜の視細胞軸索終末の3D再構築のためのサンプル調製プロトコルを概説します。このプロトコルには、網膜の解剖と固定、サンプルの埋め込みプロセス、および関心領域の選択という3つの主要なステップが含まれています。

概要

網膜には、ニューロンの軸索と樹状突起が絡み合って密集しており、それらの間にシナプスを形成しています¹。顕微鏡検査は、微細で複雑で小さな構造を持つ網膜の解剖学を研究するために不可欠なツールです。電子顕微鏡(EM)は、細胞内小器官の超微細構造や特定のタンパク質の正確な局在をナノメートルレベル²で調査するための比類のない能力を提供しますが、2次元(2D)平面に限定された画像を生成するため、重要な情報が失われる可能性があります。

新しい高解像度体積電子顕微鏡(ボリュームEM)技術の開発は、より包括的で大規模な3次元(3D)構造情報の提供をサポートします。一部の3D EM手法は、最近、他の手法によってレビューされました^3,4,5。3D EMは、ニューロンの形状と接続性の詳細の再構築を可能にし、関心のある構造の正確な定量分析を可能にします。これは、ボリュームEMによって取得されたデータが、より体系的で、完全で、正確であることを示しています。

視覚シグナル伝達

プロトコル

動物の世話と使用のプロトコルは、温州医科大学の倫理委員会によって承認され、視覚眼科研究協会(ARVO)によって確立されたガイドラインに従っていました。すべてのマウスを12時間のライトサイクルと12時間のダークサイクルで維持し、標準的なチャウ食餌を与えました。

1. 網膜の解剖と固定

1. マウス(C57BL / 6J、雄、8週齢、20-25 g)に2,2,2-トリブロモエタノール(0.25 mg / g体重)を腹腔内に注入して麻酔します。.つま先をつまんだ後足を引っ込めない、またはまばたき反射をしないことで、麻酔の深さを確認します。次に、麻酔下で頸椎を脱臼して動物を安楽死させます。
   注:トリブロモエタノールは、小動物モデル、特に短期間の処置において、迅速で信頼性の高い麻酔を誘発する有効性が十分に文書化されているために選択されました。医薬品グレードの麻酔薬が好まれますが、トリブロモエタノールは特定のプロトコルで特定の利点を提供するため、適切に準備および投与された場合、適切な代替手段となります。その安全で効果的な使用を確保するために、すべての予防措置が講じられました。この研究は、その使用に関連する潜在的なリスクを軽減するために、適切な準備、管理、および監視を確保することにより、倫理的考慮事項を遵守しています。
2. 湾曲したハサミで目を取り除き、....

ディスカッション

私たちは、網膜組織における光受容体の末端構造を分析するために、OTOのボリュームEMサンプル調製プロトコルを実装しました。焦点は、網膜の剥離と固定から始まり、視細胞軸索終末の3D再構成の結果を示すことまで、手順全体を詳細に説明することでした。

網膜組織の特徴は、脳組織とは異なり、地域差がないことです。網膜は、3層のニュ?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
Acetone	Electron Microscopy Science	10000
Amira 6.8	Thermo Fisher Scientific
CaCl2	Sigma	C-2661
Embedding mold	Beijing Zhongjingkeyi Technology	GP10590
Epon resin	Electron Microscopy Science	14900
Ethanol	Sigma	64-17-5
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Science	16020
Helios NanoLab 600i dual-beam SEM	FEI
L-aspartic acid	Sigma	56-84-8
Lead nitrate	Sigma	10099-74-8
Na2HPO4.12H2O	Sigma	71650	A component of phosphate buffer
NaH2PO4.H2O	Sigma	71507	A component of phosphate buffer
OsO4	TED PELLA	4008-160501
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Science	157-8
Potassium ferrocyanide	Sigma	14459-95-1
Sodium cacodylate	Sigma	6131-99-3
Sputter coater	Leica	ACE200
Thiocarbohydrazide	Sigma	2231-57-4
Uranyl acetate	TED PELLA	CA96049