腸粘膜免疫応答を解析するための免疫適格腸内チップモデル

要約

当社の詳細なプロトコルは、3D構造とさまざまな細胞タイプでヒトの腸粘膜をシミュレートし、微生物のコロニー形成に応答した免疫応答と細胞機能の詳細な分析を可能にする高度な腸オンチップモデルの作成と使用について概説しています。

要約

上皮の3D器官型絨毛様および陰窩様構造を再現する高度な腸オンチップモデルが開発されました。免疫適格モデルには、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)、Caco-2腸上皮細胞、組織常在マクロファージ、樹状細胞が含まれ、これらは組織内で自己組織化し、ヒト腸粘膜の特性を反映しています。このプラットフォームのユニークな側面は、循環するヒト初代免疫細胞を統合し、生理学的関連性を高める能力です。このモデルは、細菌や真菌のコロニー形成や感染に対する腸管免疫系の反応を調べるために設計されています。キャビティサイズが拡大しているため、このモデルは、透過アッセイ、サイトカイン放出、免疫細胞浸潤などの多様な機能的読み出しを提供し、上皮細胞層によって形成される3D構造の免疫蛍光測定に適合します。これにより、細胞の分化と機能に関する包括的な洞察が得られます。このインタインオンチッププラットフォームは、微生物叢の代理とヒト宿主組織との間の微生物叢の代理と、微生理学的灌流バイオチッププラットフォーム内での複雑な相互作用を解明する可能性を実証しています。

概要

Organ-on-Chip(OoC)システムは、従来の2D細胞培養と動物モデルとの間のギャップを埋めることができる3D細胞培養の新たな技術です。OoCプラットフォームは、典型的には、メンブレンまたはハイドロゲル1のような広範囲の足場上で増殖した組織特異的細胞を含む1つ以上のコンパートメント^{からなる。}モデルは、1つ以上の定義された器官型機能を模倣することができます。ポンプは、細胞の老廃物を除去するための細胞培養培地の連続的なマイクロ流体灌流、細胞分化を改善するための栄養因子と成長因子の供給、および必要なin vivo条件の再現を可能にします。免疫細胞の統合により、OoCシステムはin vitroでヒトの免疫応答を模倣^{することができます2。}これまでに、さまざまな臓器や機能単位が発表されてきました¹。これらのシステムには、血管系³、肺⁴、肝臓^2,5、および腸⁶のモデルが含まれ、薬物試験^5,7および感染研究

プロトコル

このプロトコルでは、健康なドナーからバイオチップ1本あたり~20mLの新鮮な血液を摂取し、ヒトの初代単球を分離する必要があります。すべてのドナーは、この研究に参加するために書面によるインフォームドコンセントを提供し、イエナ大学病院の倫理委員会によって承認されました(許可番号2018-1052-BO)。資料の詳細については、 資料表をご参照ください。すべての溶液と培地の組成の詳細については、 表1を参照してください。

1. バイオチップの取り扱いに関する一般的な注意事項

1. リザーバーのストリップを慎重に分離し、加熱されたナイフを使用して蓋を取り外して、単一のリザーバーと蓋を取得します。シリコンチューブがぴったりと収まるように、蓋の穴を広げます。
2. シリコンチューブの内径は0.5mmで、非対称で、2つのチューブポンプストッパーによって長い(20cm)側と短い側(12cm)に分かれています。バイオチップごとに各対称の2本のチューブを組み立てるには、チューブをオスのルアーロックコネクタとチューブの反対側の蓋に取り付けます。また、バイオチップごとに4つのリザーバーを組み立てます。
   注:チューブとリザーバーを事前に準備し、使用前にオートクレーブ滅菌してください。シリコーンチューブの寿命は限られているため、3〜5回の実験後にチューブを交換してくださ....

ディスカッション

提示されたプロトコルは、免疫適格な腸オンチップモデルを生成するために必要な手順を詳述しています。免疫蛍光顕微鏡法、サイトカインおよび代謝物分析、フローサイトメトリー、タンパク質および遺伝子分析、透過性測定などの特定の技術と可能な読み出し方法について説明しました。

記載されたモデルは、初代HUVEC、単球由来マクロファージ、および単球由来樹.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plate black, clear bottom	Thermo Fisher	10000631	Consumables
Acetic acid	Roth	3738.4	Chemicals
Alexa Fluor 488 AffiniPure, donkey, anti-mouse IgG (H+L)	Jackson Immuno Research	715-545-150	Secondary Antibody Vascular Staining and Epithelial Staining
Alexa Fluor 647 AffiniPure, donkey, anti-rabbit IgG (H+L)	Jackson Immuno Research	711-605-152	Secondary Antibody Epithelial Staining
Alexa Fluor 647, donkey, anti-rabbit IgG (H+L)	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen	A31573	Secondary Antibody Vascular Staining
Axiocam ERc5s camera	Zeiss	426540-9901-000	Technical equipment
Basal Medium MV, phenol red-free	Promocell	C-22225	Cell culture consumables
Biochip	Dynamic 42	BC002	Microfluidic consumables
BSA fraction V	Gibco	15260-037	Cell culture consumables
C2BBe1 (clone of Caco-2)	ATCC	CRL-2102	Epithelial Cell Source
Chloroform	Sigma	C2432	Chemicals
CO2 Incubator	Heracell	150i	Technical equipment
Collagen IV from human placenta	Sigma-Aldrich	C5533	Cell culture consumables
Coverslips (24 x 40 mm; #1.5)	Menzel-Gläser	15747592	Consumables
Cy3 AffiniPure, donkey, anti-goat IgG (H+L)	Jackson Immuno Research	705-165-147	Secondary Antibody Vascular Staining
Cy3 AffiniPure, donkey, anti-rat IgG (H+L)	Jackson Immuno Research	712-165-150	Secondary Antibody Epithelial Staining
DAPI (4',6-Diamidin-2-phenylindol, Dilactate)	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen	D3571	Vascular and Epithelial Staining
Descosept PUR	Dr.Schuhmacher	00-323-100	Cell culture consumables
DMEM high glucose	Gibco	41965-062	Cell culture consumables
DMEM high glucose w/o phenol red	Gibco	31053028	Cell culture consumables
DPBS (-/-)	Gibco	14190-169	Cell culture consumables
DPBS (+/+)	Gibco	14040-133	Cell culture consumables
EDTA solution	Invitrogen	15575-038	Cell culture consumables
Endothelial Cell Growth Medium	Promocell	C-22020	Cell culture consumables
Endothelial Cell Growth Medium supplement mix	Promocell	C-39225	Cell culture consumables
Ethanol 96%, undenatured	Nordbrand-Nordhausen	410	Chemicals
Fetal bovine Serum	invitrogen	10270106	Cell culture consumables
Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran (3-5 kDa)	Sigma Aldrich	FD4-100MG	Chemicals
Fluorescent Mounting Medium	Dako	S3023	Chemicals
Gentamycin (10mg/mL)	Sigma Aldrich	G1272	Cell culture consumables
GlutaMAX Supplement (100x)	Gibco	35050061	Cell culture consumables
Histopaque	Sigma-Aldrich	10771	Cell culture consumables
Hoechst (bisBenzimid) H33342	Sigma-Aldrich	14533	Epithelial Staining
Holotransferrin (5mg/mL) Transferrin, Holo, Human Plasma	Millipore	616397	Cell culture consumables
Human recombinant GM-CSF	Peprotech	300-30	Cell culture consumables
Human recombinant M-CSF	Peprotech	300-25	Cell culture consumables
Illumination device	Zeiss	HXP 120 C	Fluorescence Microscope Setup
Laser Scanning Microscope	Zeiss	CLSM980	Fluorescence Microscope Setup
Lidocain hydrochloride	Sigma-Aldrich	L5647	Cell culture consumables
Lipopolysaccharide (LPS)	Sigma	L2630	Cell culture consumables
Loftex Wipes	Loftex	1250115	Consumables
Low attachment tubes (PS, 5 mL)	Falcon	352052	Consumables
Luer adapter for the top cap (M)	Mo Bi Tec	M3003	Microfluidic consumables
Male mini luer plugs, row of four,PP, opaque	Microfluidic chipshop	09-0556-0336-09	Microfluidic consumables
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140	Cell culture consumables
Methanol	Roth	8388.2	Chemicals
Microscope	Zeiss	Axio Observer 5	Fluorescence Microscope Setup
Microscope slides	Menzel	MZ-0002	Consumables
Monoclonal, mouse, anti-human CD68 Antibody (KP1)	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen	14-0688-82	Primary Antibody Vascular Staining
Monoclonal, rat, anti-human E-Cadherin antibody (DECMA-1)	Sigma-Aldrich, Millipore	MABT26	Primary Antibody Epithelial Staining
Multiskan Go plate reader	Thermo Fisher	51119300	Technical equipment
Normal donkey serum	Biozol	LIN-END9010-10	Chemicals
Optical Sectioning	Zeiss	ApoTome	Fluorescence Microscope Setup
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122	Cell culture consumables
Plugs	Cole Parmer	GZ-45555-56	Microfluidic consumables
Polyclonal, goat, anti-human VE-Cadherin Antibody	R&D Systems	AF938	Primary Antibody Vascular Staining
Polyclonal, rabbit, anti-human Von Willebrand Factor Antibody	Dako	A0082	Primary Antibody Vascular Staining
Polyclonal, rabbit, anti-human ZO-1 antibody	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen	61-7300	Primary Antibody Epithelial Staining
Power Supply Microscope	Zeiss	Eplax Vp232	Fluorescence Microscope Setup
Primovert microscope	Zeiss	415510-1101-000	Technical equipment
Reglo ICC peristaltic pump	Ismatec	ISM4412	Technical equipment
SAHA (Vorinostat)	Sigma Aldrich	SML0061-25MG	Chemicals
Saponin	Fluka	47036	Chemicals
S-Monovette, 7.5 mL Z-Gel	Sarstedt	01.1602	Consumables
S-Monovette, 9.0 mL K3E	Sarstedt	02.1066.001	Consumables
Sodium Pyruvate	Gibco	11360-088	Cell culture consumables
Tank 4.5 mL	ChipShop	10000079	Microfluidic consumables
Trypane blue stain 0.4%	Invitrogen	T10282	Cell culture consumables
Trypsin	Gibco	11538876	Cell culture consumables
Tubing	Dynamic 42	ST001	Microfluidic consumables
Tweezers (Präzisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm)	Roth	K343.1	Consumables
Wheat Germ Agglutinin (WGA)	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen	W32464	Epithelial Staining
X-VIVO 15	Lonza	BE02-060F	Cell culture consumables, Hematopoietic cell medium
Zellkultur Multiwell Platten, 24 Well, sterile	Greiner Bio-One	662 160	Consumables
Zellkultur Multiwell Platten, 6 Well, sterile	Greiner Bio-One	657 160	Consumables
Zen Blue Software	Zeiss	Version 3.7	Microscopy Software