新生児マウス骨髄単離と骨髄由来マクロファージの調製

要約

このプロトコルは、7-9日齢の新生児マウス骨髄細胞を単離し、L929細胞の上清を顆粒球コロニー刺激因子(M-CSF)の供給源として使用して分化したマクロファージを生成するための非酵素的で簡単な方法を説明しています。骨髄由来マクロファージは、表面抗原F4/80、CD206、CD11b、および機能的コンピテンシーについてさらに分析されました。

要約

成体マウスから骨髄を分離するためのさまざまな技術が確立されています。しかし、新生児マウスから骨髄を分離することは困難で時間がかかりますが、一部のモデルでは、翻訳的に関連性があり、必要です。このプロトコルは、7〜9日齢の子犬から骨髄細胞を調製するための効率的で簡単な方法を説明しています。その後、これらの細胞をさらに単離したり、目的の特定の細胞タイプに分化させたりすることができます。マクロファージは、炎症や感染に大きな役割を果たす重要な免疫細胞です。発生中、新生児マクロファージは組織のリモデリングに大きく寄与します。さらに、新生児マクロファージの表現型と機能は、成人のマクロファージの表現型と機能とは異なります。このプロトコルはまた、L929馴化培地の存在下での単離された骨髄細胞からの新生児マクロファージの分化を概説しています。分化した新生児マクロファージの表面マーカーをフローサイトメトリー解析を用いて評価した。機能性を実証するために、pH感受性色素標識大 腸菌を用いて食作用効率も試験しました。

概要

骨髄は、自家再生可能でさまざまな細胞系譜に分化できる造血幹細胞集団と間葉系幹細胞集団の両方を囲んでいます。骨髄の造血幹細胞は、骨髄系およびリンパ系^1を生じさせます。間葉系幹細胞は、骨芽細胞(骨)、脂肪細胞(脂肪)、または軟骨細胞(軟骨)を産生します²。これらの細胞は、遺伝子治療^3,4を含む細胞生物学および組織工学の分野で複数の用途があります。骨髄に存在する前駆細胞は、系統特異的な成長因子の存在下で特定の細胞型に分化します。エリスロポエチンは赤血球前駆細胞の増殖を促進し、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)は好中球コロニーの成長を刺激し、トロンボポエチンは血小板の産生を調節するなど、系統特異的な成長因子のいくつかの例として挙げられます⁵。細胞表面抗原標識FACSおよび磁気活性化セルソーティング(MACS)は、特定の骨髄由来細胞タイプの単離および精製のための確立された方法です⁶。

新生児研究は、新生児の死亡原因の解明や早産時の合併症への対処に向けて進んでいますが、直接的な治療法の開発は依然としてアンメットメディカルニーズです。スミス....

プロトコル

すべての手続きは、ウェストバージニア州の動物管理および使用委員会によって承認され、全米研究評議会による実験動物の世話と使用に関するガイドの推奨事項に従って実施されました。この研究では、C57BL/6Jマウスの子マウスを使用しました。使用したすべての試薬と機器の詳細は、 材料表に記載されています。

1. 培地の準備

1. 10% FBS、2 mM グルタミン、25 mM HEPES、およびペニシリン(100 U/mL)/ストレプトマイシン(100 μg/mL)を添加した MEM 培地 3 mL を 5 mL の遠心チューブに調製し、氷上に保ちます。
2. 骨髄前駆細胞を液体窒素で保存する必要がある場合は、10%のDMEM、80%のFBS、および10%のDMSOを含む凍結培地を調製します。
3. 完全なDMEMを得るには、10% FBS、2 mMグルタミン、25 mM HEPES、およびペニシリン(100 U/mL)/ストレプトマイシン(100 μg/mL)を添加したDMEMを調製します。
4. マクロファージの分化には、10% FBS、2 mM グルタミン、ペニシリン (100 U/mL)/ストレプトマイシン (100 μg/mL)、および 10% L929 細胞上清

ディスカッション

新生児マウスモデルを用いた研究には、多くの課題があります。新生児は、大人に比べてユニークな発達中の免疫システムを持っています⁸。そのため、成体動物モデルから生成されたデータは新生児に適用されると想定すべきではなく、いくつかの公開された研究はこの考えをよく明確にしています^18,19。したがって、新生児特?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 µm strainer	Greiner	542040	Cell culture
96 well round (U) bottom plate	Thermo Scientific	12-565-65	Cell culture
Anti-mouse CD11b-BV786	BD Biosciences	740861	FACS analysis
Anti-mouse CD206-Alexa Fluor488	BD Biosciences	141709	FACS analysis
Anti-mouse F4/80-PE	BD Biosciences	565410	FACS analysis
Countess3	Thermo Scientific	TSI-C3ACC	Automated cell counter
DMEM	Hyclone	SH30022.01	Cell culture
DMSO	VWR	WN182	Cell culture
DPBS, 1x	Corning	21-031-CV	Cell culture
Escherichia coli O1:K1:H7	ATCC	11775	Infection
EVOS FL	Invitrogen	12-563-649	Cell Imaging System
FBS	Avantor	76419-584	Cell culture
FluoroBright BMDM	Thermo fisher Scientific	A1896701	Dye free culture media
Glutamine	Cytiva	SH30034.01	Cell culture
HEPES	Cytiva	SH30237.01	Cell culture
L-929	ATCC		Differentiation
LSRFortessa	Becton Dickinson		Flowcytometer
Lysotracker red DND 99	Invitrogen	L7528	Fluorescent dye
MEM	Corning	15-010-CV	Cell culture
Penicillin /streptomycin	Hyclone	SV30010	Cell culture
pHrodo green STP ester	Invitrogen	P35369	Fluorescent dye
T75 flask	Cell star	658170	Cell culture
Trypsin-EDTA	Gibco	25300120	Cell culture
Zeiss 710	Zeiss	P20GM103434	Confocal