光生体調節増強を用いたハイドロゲル中での脂肪由来幹細胞の三次元細胞培養

要約

ここでは、脂肪由来幹細胞(ADSC)培養のための3次元(3D)細胞培養フレームワークとしてのハイドロゲルの使用と、3D培養環境内でのADSCの増殖を促進するための光生体調節(PBM)の導入を実証するプロトコルを紹介します。

要約

脂肪由来幹細胞(ADSC)は、幹細胞に似た多能性間葉系の特徴を持ち、多様な細胞分化能を持ち、遊走・増殖の促進・炎症緩和などの能力を有することから、再生医療に利用されています。しかし、ADSCは、主に好ましくない炎症状態のために、創傷内での生存と生着に課題に直面することがよくあります。この問題に対処するために、創傷におけるADSCの生存率を維持し、創傷治癒プロセスを促進するハイドロゲルが開発されました。ここでは、3D細胞培養フレームワーク内でのADSC増殖と細胞毒性に対する光生体調節(PBM)の相乗効果を評価することを目的としていました。不死化ADSCを10μLのハイドロゲルに2.5×10³ 細胞の密度で播種し、525nmおよび825nmのダイオードを用いて5J/^cm2 および10J/^cm2の流暢さで照射した。形態学的変化、細胞毒性、および増殖は、PBM曝露後24時間および10日後に評価されました。ADSCは丸みを帯びた形態を示し、個々の細胞またはスフェロイド凝集体としてゲル全体に分散していました。重要なことは、PBMと3D培養フレームワークの両方が細胞に細胞傷害性の影響を示さなかったのに対し、PBMはADSCの増殖速度を有意に高めたことです。結論として、この研究は、ADSC培養に適した3D環境としてのハイドロゲルの使用を実証し、特に3D細胞培養に関連する増殖速度の遅さに対処する重要な増強戦略としてPBMを導入します。

概要

ADSCは、自己複製して複数の細胞系統に分化する能力を持つ間葉系多能性前駆細胞です。これらの細胞は、脂肪吸^引法中に脂肪組織の間質血管分画(SVF)から採取することができる1。ADSCは、豊富で、採取に対する侵襲性が低く、入手が容易で、特性が良好であるため、再生医療に使用するのに理想的な幹細胞タイプとして浮上しています²。幹細胞治療は、細胞の遊走、増殖、血管新生を刺激し、創傷内の炎症を軽減することにより、創傷治癒の道筋を提供します^3,4。ADSCの再生能力の約80%は、セクレトーム⁵を介したパラクリンシグナル伝達に起因しています。以前は、損傷した組織に幹細胞または成長因子を直接局所的に注入すると、in vivo修復メカニズムが十分に低下する可能性があることが示唆されていました^6,7,8。しかし、このアプローチは、生存率の低下や、^{炎症環境の結果として}損傷した組織内の幹細胞生着の減少など、いくつかの課題に直面していました9。さらに....

プロトコル

注:このプロトコルで使用されるすべての材料、試薬、およびソフトウェアに関する詳細については、 材料表 を参照してください。プロトコルを 図1にまとめました。

1. 2次元(2D)細胞培養

注:不死化ADSC(1 x10⁶ 細胞)は、1 mLの細胞凍結培地を含む凍結保存バイアル内の液体窒素中で-195.8°Cで保存されます。

1. 2D細胞回収培地および2D培養フラスコの調製
   1. 39 mLの基礎培地を50 mLの遠心チューブに移します
   2. 20%ウシ胎児血清(FBS;10 mL)と抗生物質(1 mL)(0.5 mLペニシリン-ストレプトマイシンおよび0.5 mLアムホテリシンB)で基礎培地を濃縮します。.
   3. 6 mLの細胞回収培地をフラスコに移してT75フラスコをプレコンディショニングし、37°C、5%_CO2、湿度85%で45分間インキュベートします(これは、時間を節約するために細胞回収ステップの実行中に行うことができます)。
      注:使用前に培地全体を37°Cに温め、4°Cで最大1週間保管してください。
2. 2D細胞回収
   1. 液体窒素貯蔵....

ディスカッション

ADSCは、創傷治癒を助けるさまざまなプロセスを刺激するため、再生医療に使用するのに理想的な細胞タイプです^3,4。しかし、生存率の低さや^損傷部位での細胞の生着効果のなさなど、回避しなければならないいくつかの課題があります9。不死化細胞は、初代細胞と比較してより多くの世代にわたって継代することができ、収穫す.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
525 nm diode laser	National Laser Centre of South Africa	EN 60825-1:2007
825 nm diode laser	National Laser Centre of South Africa	SN 101080908ADR-1800
96 Well Strip Plates	Sigma-Aldrich	BR782301
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	A2942	Antibiotic (0.5%; 0.5 mL)
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay	Promega	G9681	ATP reagent, Proliferation assay Kit
Corning 2 mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial	Corning	430659	cryovial
CryoSOfree	Sigma-Aldrich	C9249	Cell freezing media
CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay	Promega	G1780	Cytotoxicity reagent
Dulbecco’s Modified Eagle Media	Sigma-Aldrich	D5796	Basal medium (39 mL/44 mL)
FieldMate Laser Power Meter	Coherent	1098297
Flat-bottomed Corning 96 well clear polystyrene plate	Sigma-Aldrich	CLS3370
Foetal bovine serum	Biochrom	S0615	Culture medium enrichment (5 mL; 10% / 10 mL; 20%)
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma-Aldrich	H9394	Rinse solution
Heracell 150i CO2 incubator	Thermo Scientific	51026280
Heraeus Labofuge 400	Thermo Scientific	75008371	Plate spinner for 96 well plates
Heraeus Megafuge 16R centrifuge	ThermoFisher	75004270
Immortalized ADSCs	ATCC	ASC52Telo hTERT, ATCC SCRC-4000	Passage 37
Invitrogen Countess 3	Invitrogen	AMQAX2000	Automated cell counter for Trypan Blue
Julabo TW20 waterbath	Sigma-Aldrich	Z615501	Waterbath used to warm media to 37 °C
Olympus CellSens Entry	Olympus	Version 3.2 (23706)	Imaging software: digital image acquisition
Olympus CKX41	Olympus	SN9B02019	Inverted light microscope
Olympus SC30 camera	Olympus	SN57000530	Camera attached to inverted light microscope
Opaque-walled Corning 96 well solid polystyrene microplates	Sigma-Aldrich	CLS3912	Opaque well used for ATP luminescence
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	Antibiotic (0.5%; 0.5 mL)
SigmaPlot 12.0	Systat Software Incorporated
TrueGel3D – True3	Sigma-Aldrich	TRUE3-1KT	10 µL
TrueGel3D Enzymatic Cell Recovery Solution	Sigma-Aldrich	TRUEENZ	01:20
Trypan Blue Stain	Thermo Fisher - Invitrogen	T10282	0.4% solution
TrypLE Select Enzyme (1x)	Gibco	12563029	Cell detachment solution
Victor Nivo Plate Reader	Perkin Elmer	HH3522019094	Spectrophotometric plate reader