髄芽腫のフェロトーシス表現型の解明

要約

脂質ヒドロペルオキシド含有量は、フェロトーシス細胞死の最も一般的に使用される指標です。この記事では、フェロトーシス誘導時の細胞内の脂質ヒドロペルオキシド含有量のフローサイトメトリーの段階的な分析について説明します。

要約

鉄と酸素の相互作用は、地球上の生命の発達に不可欠な部分です。それにもかかわらず、このユニークな化学は魅了され、困惑し続け、新しい生物学的ベンチャーにつながります。2012年、コロンビア大学のグループは、この相互作用が「フェロトーシス」と呼ばれる新しいタイプの制御細胞死につながる中心的なイベントであると認識しました。フェロトーシスの主な特徴は、(1)機能不全の抗酸化防御および/または(2)圧倒的な酸化ストレスによる脂質ヒドロペルオキシドの蓄積であり、これは最も頻繁に細胞内の遊離不安定鉄の含有量の増加と一致します。これは通常、シスチントランスポーターxCT、グルタチオン(GSH)、およびGSHペルオキシダーゼ4(GPx4)を含む標準的な抗フェロトーシス軸によって防止されます。フェロトーシスはプログラムされたタイプの細胞死ではないため、アポトーシスに特徴的なシグナル伝達経路は関与しません。このタイプの細胞死を証明する最も一般的な方法は、親油性抗酸化物質(ビタミンE、フェロスタチン-1など)を使用して細胞死を防ぐことです。これらの分子は、原形質膜の酸化的損傷に接近し、解毒することができます。フェロトーシスの表現型を明らかにする上でのもう一つの重要な側面は、特定の色素BODIPY C11が使用される脂質ヒドロペルオキシドの先行蓄積を検出することです。本稿では、エラスチン、RSL3、鉄供与体などのさまざまな誘導物質を使用して、野生型髄芽腫細胞でフェロトーシスを誘導する方法を示します。同様に、NACの存在下で増殖し、NACが除去されるとフェロトーシスを受けるxCT-KO細胞が使用されます。特徴的な「バブリング」表現型は、フェロトーシスが引き起こされた瞬間から12〜16時間以内に光学顕微鏡で見ることができます。さらに、PI染色法を使用して脂質ヒドロペルオキシドの蓄積とその結果としての細胞死を示すためのBODIPY C11染色とそれに続くFACS分析が使用されます。細胞死のフェロトーシス特性を証明するために、フェロスタチン-1 は特定のフェロトーシス予防剤として使用されます。

概要

フェロトーシスは、新たに状況化された活性酸素種(ROS)依存型の細胞死¹です。ROSに加えて、鉄はこのタイプの細胞死において重要な役割を果たしているため、²という名前が付けられています。フェロトーシスの最終的かつ実行的なステップは、鉄触媒による脂質の酸化的損傷の細胞膜への蓄積であり、最終的には膜の完全性と選択的透過性の低下、そして最終的にはバブリングによる細胞死につながります。脂質のヒドロ過酸化イベントは自然に発生する現象です。しかしながら、細胞膜全体へのその伝播は、細胞の抗酸化防御によって妨げられる。この文脈での主要なプレーヤーは、Se-タンパク質グルタチオンペルオキシダーゼ4(GPx4)であり、膜に接近して脂質ヒドロペルオキシドを毒性の低いアルコール誘導体^{に変換することができます3}。GPx4の還元力は、主に非必須アミノ酸(グリシン、グルタミン酸、システイン)で構成されるトリペプチドであるグルタチオン(GSH)によって提供されますが、これに限定されません。GSHの生合成のための律速アミノ酸はシステイン⁴です。システインは非必須アミノ酸として分類されますが、その必要量は、増殖性の高い細胞(がん細胞など)では容易に内部産生を超える可能性があります。したがって、半必須アミノ酸のグループに再分類されました。システインの必要な輸入は、主にXc-システムを通じて行われ、これにより、グルタミン酸^{の輸出を犠牲に}して、酸化された(支配的な)形態のシステイン(別名シスチン)の輸入が可能になります5。Xc-システムは、xCTとして知られるNa+非依存性Cl依存性の輸送サブユニットと、CD98として知られるシャペロンサブユニットで構成されています。最近まで、xCT-GSH-GPx4軸の抗フェロトーシス特性は、ユニークで再現不可能であると考えられてきました⁶。しかし、2019年には、ユビキノール(コエンザイムQ10)とその再生酵素であるフェロトーシス抑制タンパク質1(FSP1)からなる代替の抗フェロトーシス経路が記載されています^7,8。その後まもなく、GTPシクロヒドロラーゼ-1/テトラヒドロビオプテリン(GCH1/BH4)を含む脂質ヒドロペルオキシド解毒システムがさらに報告されています⁹。それにもかかわらず、フェロトーシスの予防におけるxCT-GSH-GPx4軸の中心的な役割は挑戦されていないようです。

過去 10 年間で、フェロトーシスはさまざまな種類の腫瘍で広く研究され、抗がん戦略として大きな可能性を示しています (Lei et ^al.10 によるレビュー)。さらに、従来の化学療法に対して高い耐性を示すがん細胞や転移傾向を示すがん細胞は、GPx4の阻害剤などのフェロトーシス誘導物質に対して驚くほど感受性が高いことが報告されています11,12,13。しかし、脳腫瘍の文脈では、フェロトーシス誘導剤の可能性は依然としてほとんど研究されていません。このタイプの細胞死は、脳虚血再灌流障害¹⁴および神経変性疾患¹⁵と密接に関連していますが、脳腫瘍の文脈でのその可能性は、主に最も一般的な悪性頭蓋脳腫瘍である膠芽腫に限定されています(Zhuoら^{によるレビュー16})。一方、最も一般的な悪性小児脳腫瘍であり、小児死亡の主な原因である髄芽腫のフェロトーシス誘導物質に対する感受性は、ほとんど解明されていません。私たちの知る限りでは、フェロトーシスと髄芽腫を関連付ける査読済みの文献はほとんどありません。それにもかかわらず、いくつかの研究は、鉄が髄芽腫と膠芽腫がん幹細胞(CSC)の両方の生存、増殖、および腫瘍形成の可能性に重要な役割を果たしていることを明らかにしています^17,18、潜在的にそれらをフェロトーシス誘導に対してより脆弱にします。髄芽腫は、CSC、または腫瘍開始/増殖細胞の亜集団で悪名高く、腫瘍の化学療法抵抗性、播種、および再発に大きく関与していると思われるため、これは特に重要です¹⁹。

フェロトーシス誘導に対する感度は、通常、脂質ヒドロペルオキシドの含有量/蓄積を測定することによって調査されますが、これは細胞死につながる場合とそうでない場合があります。最も一般的に使用されるフェロトーシス誘導物質は、(1)xCTトランス^{ポーター20}の阻害剤であるエラスチン、(2)GPx4酵素²の阻害剤であるRSL3、および/または(3)クエン酸フェロアンモニウム(FAC)²¹などの鉄供与体である。脂質ヒドロペルオキシド含有量は、選択的プローブBODIPY 581/591 C11²²を使用して評価されます。このプローブは、還元状態で581/591 nmに励起および発光が最大です。脂質ヒドロペルオキシドとの相互作用と酸化により、プローブはその励起および発光の最大値を488/510 nmにシフトします。通常、脂質ヒドロペルオキシド含有量の大幅な増加は、フェロトーシス細胞死に先行します。フェロトーシスはプログラムされた細胞死ではないため、その実行につながる分子シグナル伝達カスケードはありません。したがって、それを確認する唯一の方法は、脂質ヒドロペルオキシド含有量を監視し、このタイプの細胞死に対してフェロスタチン1²³などの特定の阻害剤を使用することです。フェロスタチン1は、細胞の脂質コンパートメントに浸透し、脂質ヒドロペルオキシドを解毒し、それによってフェロトーシスイベントを防止できる親油性抗酸化物質です。

プロトコル

本研究は、DAOY野生型(WT)髄芽腫細胞株を用いて実施され、これを37°Cで培養し、5%CO₂ 含有DMEM培地に8%FBSを添加した。xCT欠失細胞株は、1 mM N-アセチルシステイン(NAC)を添加した培地で実験を行い、同じ条件下で維持しました。細胞は、市販のマイコプラズマ検出キット( 材料表を参照)を使用してマイコプラズマについて定期的にスクリーニングされ、10^継 代目まで培養されました。

1. 細胞の収穫と播種

注:すべてのステップは、組織培養層流フードで滅菌無菌技術を使用して実行されます。DAOY髄芽腫細胞は接着性であり、Ca2⁺ およびMg²⁺を含まないリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄することにより、付着していないすべての細胞を廃棄できます。

1. 細胞の入ったストックディッシュ(シャーレ、直径100mm)を取り、アスピレーターを使用してプレートから浮遊細胞と培地を取り除きます。
2. 皿に5〜10 mLのPBSを追加し、皿の円を描く動きで底を洗い、吸引器を使用してPBSをプレートから取り出します。
3. トリプシン1mL(10倍希釈)を皿に加えます。プレートを軽くたたくと細胞が取り除かれるまで、プレートをインキュベートします。8% FBSを添加したDMEM培地10 mLを取り出し、皿から細胞を機械的に回収します。
4. 細胞懸濁液を15mLチューブに移します。
5. 細胞懸濁液500μLを取り出し、キュベットに入れて計数します。細胞懸濁液のmLあたりの細胞数を数えます。この研究では、自動セルカウンターを使用しました( 資料の表を参照)。
6. 細胞懸濁液から取り出すのに必要な量を計算して、1,00,000個の細胞を持ちます。
7. 6ウェルプレートを取り、計算された量の細胞懸濁液を各ウェルに加え、8% FBSを添加したDMEM培地を各ウェルに2mL加えます。

2.細胞の処理

注:制御と治療は3回で行われます。グループは次のとおりです:コントロール(DMSO)、1μMのエラスチン、0.3μMのRSL3、250μMのFAC、2μMのフェロスタチン1、1μMのエラスチン+2μMのフェロスタチン1、0.3μM RSL3+2μMのフェロスタチン1、250μMのFAC+2μMのフェロスタチン1。実験には、 表1に示すように、4枚の6ウェルプレートが必要です。必要なすべての試薬の商業的な詳細は、 材料表に記載されています。

1. 播種後24時間後、対応する処理を細胞とともにウェルに加えます。
2. ディッシュを37°C、5%_CO2 のインキュベーターに置いておきます。

3. BODIPY 581/591 C11プローブによる処理細胞の脂質ヒドロペルオキシド染色

注:脂質ヒドロペルオキシド特異的プローブのストック溶液は、DMSOで1 mMの濃度で調製されます。原液のアリコートは、-20°Cで不透明なチューブで保存します。染色には、8% FBSを添加したDMEM培地中のプローブの2 μMワーキング溶液を調製します。

1. 処理の6時間後、光学顕微鏡で細胞を観察します(細胞の丸みが見えるはずです)。
2. インキュベーターから皿を取り出し、組織培養層流フードに入れます。
   アスピレーターを使用して、メディアと浮遊(死んだ)細胞を取り除きます。
3. 各ウェルに2 mLのPBSを静かに加え、6ウェルプレートの円を描くようにして底を洗浄し、アスピレーターを使用してウェルからPBSを取り除きます。
4. プローブの作業溶液2 mL(DMEMにFBSを添加した最終濃度2 μM)を加えます。
5. ディッシュを37°Cおよび5%CO₂ のインキュベーターに30分間暗所で放置します(プレートはアルミホイルで包むことができます)。

4. 処理細胞中の脂質ヒドロペルオキシド含量のフローサイトメトリー解析

注意: 次の手順はすべて、暗闇で実行されます(層流フードにライトはありません)。

1. インキュベーターから皿を取り出し、組織培養層流フードに入れます。
   吸引器を使用して、染色液を除去します。
2. 各ウェルに2 mLのPBSを静かに加え、6ウェルプレートの円を描くようにして底を洗浄し、アスピレーターを使用してウェルからPBSを取り除きます。
3. 洗浄手順をもう一度繰り返し、吸引器を使用してウェルから残っているPBSを吸引します。
4. 各ウェルの底に市販の細胞解離試薬( 材料表を参照)150 μLを加え、プレートを軽くたたいて細胞が取り出されるまでプレートをインキュベートします。250 μLのFACSバッファー(PBS、2 mM EDTA、0.5% BSA)を取り、ウェルから細胞を機械的に回収します。
5. 細胞をフィルターキャップ付きの対応する(以前にマークされた)FACSチューブに移します。分析が行われるまで、細胞を氷上に載せたチューブを暗所に置きます(分析は染色後1時間以内に行う必要があります)。
   注:FACSマシンのセットアップとキャリブレーションは、使用するマシンによって異なります( 材料の表を参照)。
6. 新しい実験を作成し、名前を付けます(DAOYのフェロトーシス-脂質ヒドロペルオキシド)。
7. 実験計画では、レーザー(488 nm)とフィルター(FITC)を選択します。
8. ビューデータで、適切なセルサイズ(>12μm)を選択し、PMT電圧を設定し(セル集団はSSC-H/FSC-Hドットプロットの最初の象限に表示される必要があります)、ドットプロットをゲートします。
9. 新しいプロット - ヒストグラムを追加し、Y 軸に FITC-A と対数スケールを配置します。
10. FACSチューブ内のサンプルをボルテックスし、FACSマシンに入れてサンプルをロードします。10,000 個の FSC シングレット イベントを記録し、ファイルに名前を付けます (例: DAOY WT CTL 6h)。ファイルを .fcs としてエクスポートします。

5. ヨウ化プロピジウム(PI)による死細胞処理時の染色

注:実験デザインは、脂質ヒドロペルオキシド測定とまったく同じです(ステップ1およびステップ2を参照)。

1. 播種後24時間で、インキュベーターから皿を取り出し、層流フードに入れます。
2. 培地(死細胞を含む)を15 mLチューブに集めます。
3. 各ウェルに1 mLのPBSを加え、6ウェルプレートの円を描くようにして底を洗浄し、PBSをそれぞれの培地でチューブに集めます。
4. 各ウェルの底に200 μLのトリプシン(10倍希釈)を加え、プレートを優しく軽くたたいて細胞が取り除かれるまでプレートをインキュベートします。それぞれの培地+ PBSを使用して、ウェルから細胞を回収します。
5. 細胞懸濁液を180 x g で室温で10分間遠心分離します。吸引器を使用して上清を取り除きます。
6. 細胞ペレットを300 μLのFACSバッファーに再懸濁し、分析まで氷上に置きます。
7. 分析の直前に、PI溶液( 材料表を参照)を最終濃度2 μg/mLまで加えます。

6. 処理後24時間後の死細胞のフローサイトメトリー解析

注:FACSマシンの設定とキャリブレーションは、前に示したとおりに行われます(ステップ4を参照)。

1. 新しい実験を作成し、名前を付けます(DAOYのフェロトーシス-細胞死)。
2. 実験計画では、レーザー(488 nm)とフィルター(PE)を選択します。
3. ビューデータで、適切なセルサイズ(>12μm)を選択し、PMT電圧を設定し(セル集団はSSC-H/FSC-Hドットプロットの最初の象限に表示される必要があります)、ドットプロットをゲートします。
4. 新しいプロット - ヒストグラムを追加し、PE-A を y 軸と対数スケールにします。
5. FACSチューブ内のサンプルをボルテックスし、FACSマシンに入れてサンプルをロードします。
6. 10,000 個の FSC シングレット イベントを記録し、ファイルに名前を付けます (例: DAOY WT CTL 6h)。ファイルを .fcs としてエクスポートします。

7. DAOY xCT-/-細胞における脂質ヒドロペルオキシド含量のフローサイトメトリー解析

注:xCT^−/− 細胞は、前述のように生成されている²⁴。

1. この実験では、ステップ2で示されたように細胞を播種しますが、処理の代わりに、培地に1 mM NACを一晩補充します。
2. 翌日、NAC を 1 つのグループで保持し、もう 1 つのグループから NAC を削除します。
3. ステップ6で説明したのとまったく同じ方法で、脂質ヒドロペルオキシド含有量のフローサイトメトリー分析を実行します。

8. フローサイトメーターの結果の解析

1. FlowJo ソフトウェアで .fcs ドキュメントを開きます ( 「資料の表」を参照)。
2. 個々のファイルをダブルクリックすると、個々のサンプルに記録されたすべてのイベント(FCSシングレットだけでなく)が開きます(SSC-A/FSC-Aドットプロット)。マシン上で行われたゲートが保持されないような設定になっているため、ゲートをもう一度作成し、母集団に名前を付ける必要があります(例:DAOY WT)。
3. ゲートされた母集団をダブルクリックすると、ヒストグラムのある別のウィンドウが開きます。
4. Y軸を使用する蛍光フィルター(Comp-FITC/PE-A)に変更します。
5. X軸を モーダル に変更します(各ピークをそのモード、つまり、特定のビンで見つかったセルの最大数の%に正規化します)。
6. ヒストグラムをレイアウトエディタにコピーします。これをすべてのサンプルに対して繰り返し、新しいヒストグラムをレイアウトエディタに貼り付けるたびに、ヒストグラムがオーバーレイされるように前のヒストグラムの上にドラッグします(半分のオフセット)。

結果

髄芽腫細胞株DAOYは、8%FBSを添加した標準的なDMEM培地で、約60%のコンフルエントに達するまで培養しました。実験当日、細胞を採取し、 表1に示すように、ウェルあたり1,00,000個の細胞を6ウェルプレートに播種しました。翌日、細胞(トリプリケート)を1 μMのエラスチン、0.3 μMのRSL3、または250 μMのFACで処理しました。次に、プレートをインキュベーターに37°Cおよび5%CO₂で?...

ディスカッション

フェロトーシス細胞死の主な特徴は、原形質膜における脂質ヒドロペルオキシドの制御不能な蓄積です。この酸化的損傷は、酵素的または非酵素的な方法で発生する可能性がありますが、いずれの場合も、反応は鉄依存性/触媒性であり、これがこのタイプの細胞死の名前を説明しています。脂質のヒドロペルオキシドは、4-ヒドロキシ-2,3-トランス-ノネナール(4-HNE)やマロヌアルデヒド(MDA)な?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BODIPY 581/591 C11	Thermo Fisher	D3861
Cell counter	Beckman	Coulter Z1
DMEM medium	Gibco	10569010
Erastin	Sigma-Aldrich	E7781-5MG
Ferroamminium citrate	Acros Organics	211842500
Ferrostatin-1	Sigma-Aldrich	SML0583-25MG
Fetal bovin serum (FBS)	Dominique Dutcher	500105N1N
Flow Cytometer	BD Biosciences	FACS Melody
Gibco StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Thermo Fisher	11599686
N-acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A7250
PlasmoTest Mycoplasma Detection Kit	InvivoGen	rep-pt1
propidium iodide	Invitrogen	P3566
RSL3	Sigma-Aldrich	SML2234-25MG
Trypsin - EDTA 10X - 100 mL	Dominique Dutcher	X0930-100