自閉症スペクトラム障害の ショウジョ ウバエモデルにおける行動評価のパラダイム

要約

自閉症スペクトラム障害(ASD)は、社会的およびコミュニケーション的行動の障害と反復行動の出現に関連しています。 ショウジョウバエ モデルにおけるASD遺伝子と行動障害との相互関係を研究するために、この論文では、社会的間隔、攻撃性、求愛、グルーミング、および慣れ行動を分析するための5つの行動パラダイムについて説明します。

要約

自閉症スペクトラム障害(ASD)は、社会的相互作用やコミュニケーション能力の欠損、制限された行動や反復的な行動の強化、場合によっては学習障害や運動障害などの一般的な行動症状を伴う神経発達障害の異質なグループを包含しています。 ショウジョウバエ は、多くのヒトの疾患をモデル化するための比類のないモデル生物としての役割を果たしてきました。ASDには多くの遺伝子が関与しているため、ショウジョウバエは、障害に関与していると推定される遺伝子をテストする強力で効率的な方法として浮上しています。ASDには、さまざまな機能的役割を持つ何百もの遺伝子が関与しているため、ASDの単一の遺伝的ハエモデルは実現不可能です。代わりに、個々の遺伝子変異体、遺伝子ノックダウン、またはASD関連遺伝子のハエホモログの過剰発現ベースの研究が、これらの遺伝子産物の根底にある分子経路に関する洞察を得るための一般的な手段です。 ショウジョウバエ では、特定の行動要素の欠損を簡単に読み取ることができる多くの行動手法が利用可能です。ソーシャルスペースアッセイ、およびハエの攻撃性および求愛アッセイは、社会的相互作用またはコミュニケーションの欠陥を評価するのに有用であることが示されています。ハエのグルーミング行動は、反復行動の優れた読み出しです。ハエのアハエでは、一部のASD患者で影響を受けることがわかっているアハエの学習能力を推定するために使用されます。これらの行動パラダイムの組み合わせを利用して、ハエのヒトASD様疾患状態を徹底的に評価することができます。 Fmr1 変異型ハエ、ヒトにおけるFragile-X症候群の再現、およびハエニューロンにおけるPOGZ-ホモログ 行 ノックダウンを用いて、社会的間隔、攻撃性、求愛行動、グルーミング行動、および慣れにおける定量化可能な欠損を示しました。これらの行動パラダイムは、ハエモデルにおけるASDやその他の神経発達障害の研究に広く使用されることを前提として、ここでは最も単純でわかりやすい形で示されています。

概要

自閉症スペクトラム障害(ASD)は、神経障害の異質なグループを包含しています。これには、社会的コミュニケーションと社会的相互作用における多文脈的で持続的な欠損、および制限された反復的な行動および活動パターン^{と関心の存在}を特徴とする、さまざまな複雑な神経発達障害が含まれます1。世界保健機関(WHO)によると、世界中で100人に1人の子供がASDと診断されており、男女比は4.2²です。この病気は生後2年目または3年目に明らかになります。ASDの子供は、社会的感情的な互恵性、非言語的コミュニケーション、および関係スキルに関心がないことを示しています。彼らは、型にはまった運動、柔軟性に欠ける儀式化されたルーチンのフォロー、制限された興味への集中など、反復的な行動を示します。ASDの子供は、触覚、嗅覚、音、味覚に対して高い反応を示しますが、痛みと温度の反応は比較的低いです¹。この障害の浸透度は、ASDに苦しむ患者によっても異なるため、変動性が増加します。

ASDの現在の臨床診断は、ASD^{のすべての}形態をカバーする確認的なバイオマーカーベースまたは一般的な遺伝子検査がないため、個人の行動評価に基づいています3。遺伝的および神経生理学的基盤を解読することは、治療戦略を標的にするのに役立ちます。過去10....

プロトコル

このプロトコルで使用されるすべての材料および試薬に関連する詳細については、 材料の表 を参照してください。

1. アグレッションアッセイ

1. アグレッションアッセイアリーナの準備
   1. 標準的な24ウェルプレート(図1A)を取り、プレートの各ウェルをフライアグレッションのための単一の「アリーナ」(図1B)として使用します。各ウェルの半分を通常のフライフードで満たし、一晩乾燥させます。
      注:オプションで、イーストペーストのドットや男性の攻撃性を確保するために斬首された女性など、攻撃性の焦点をアリーナに含めることができます。
   2. 透明なプラスチック/アクリルシートは、約3〜4個のウェルの表面を覆うのに十分な量です。シートに穴を開けて、個々のハエをウェルに挿入するための直径~2.5mmの小さな開口部を作ります。
2. ハエ吸引器の準備
   1. 長さ30〜50cmのゴム/シリコンチューブを用意します(図1C1)。
   2. 200 μL (または 1,000 μL) のピペットチップを取り、細いチップから ~1 cm を切り落とします。ゴ....

ディスカッション

ショウジョウバエ は、ハエとヒトの疾患遺伝子との間の遺伝子配列の高度な保存により、ヒトの神経障害の研究のための優れたモデル生物として^{使用されています9。}数多くの堅牢な行動パラダイムにより、ヒトの疾患を再現する突然変異体に現れる表現型を研究するための魅力的なモデルとなっています。自閉症スペクトラム障害(ASD)には何百もの遺伝子が関与して.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aggression arena:
Standard 24-well plate made of transparent polystyrene			12 cm x 8 cm x 2 cm. Diameter of a single well= 18 cm. Sigma-aldrich #Z707791; depth = 1 cm
Transparent plastic/acrylic sheet			Alternative: a perforated lid of a cell culture plate
Social Space Assay:
Binder clips			19 mm
Glass sheets and acrylic sheets of customized sizes			Thickness = 5 mm
Courtship assay:
Nut and bolt with threading
Perspex sheets of customized shapes			i) Lid: A custom-made round transparent Perspex disk (2-3 mm thickness, 70 mm diameter) with one loading hole at the peripheral region and another screw hole at the center (diameter ~ 3 mm for each); ii) A second transparent thicker Perspex disk (3-4 mm thickness, 70 mm diameter), with 6-8 perforations of diameter 15 mm, equidistant from the center; iii) Base: Same as lid except without the loading hole
Grooming assay:
Diffused glass-covered LED panel			10–15-Watt ceiling mountable LED panel
Habituation and Y-maze assay
Climbing chambers			x2, Borosilicate glass
Adapter for connecting Y-maze with entry vial			Perspex, custom made, measurements in Figure 5A
Clear reagent bottles			Borosil #1500017
Gas washing stopper			Borosil #1761021
Glass vial			OD= 25 mm x Height= 85 mm; Borosilicate Glass
Odorant (Ethyl Butyrate)			Merck #E15701
Paraffin wax (liquid) light			SRL #18211
Roller clamps			Polymed #14098
Silicone tubes			OD = 0.6 cm, ID = 0.3 cm; roller clamps for flow control
Vacuum pump			Hana #HN-648 (Any aquarium pump with flow direction reversed manually)
Y-maze			Borosilicate glass
Y-shaped glass tube (borosilicate glass)			Custom made, measurements in Figure 5A
Common items:
Any software for video playback (eg.- VLC media player)			https://www.videolan.org/vlc/
Computer for video data analysis
Fly bottles			OD= 60 mm x Height= 140 mm; glass/polypropylene
Fly vials			OD= 25 mm x Height= 85 mm; Borosilicate Glass
Graph-pad Prism software			https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/www.graphpad.com/scientific-software/prism/
ImageJ software			https://imagej.net/downloads
Timer
Video camera with video recording set up			Camcorder or a mobile phone camera will work
For Fly Aspirator:
Cotton			Absorbent, autoclaved
Parafilm			Sigma-aldrich #P7793
Pipette tips			200 µL or 1000 µL, choose depeding on outer diameter of the silicone tube
Silicone/rubber tube			length= 30-50 cm. The tube should be odorless
Composition of Fly food:
Ingredients (amount for 1 L of food)
Agar (8 g)			SRL # 19661 (CAS : 9002-18-0)
Cornflour (80 g)			Organic, locally procured
D-Glucose (20 g)			SRL # 51758 (CAS: 50-99-7)
Propionic acid (4 g)			SRL # 43883 (CAS: 79-09-4)
Sucrose (40 g)			SRL # 90701 (CAS: 57-50-1)
Tego (Methyl para hydroxy benzoate) (1.25 g)			SRL # 60905 (CAS: 5026-62-0)
Yeast Powder (10 g)			HIMEDIA # RM027
Fly lines used in the experiments in this study:
Wild type (Canton S or CS)			BDSC # 64349
w1118			BDSC # 3605
w[1118]; Fmr1[Δ50M]/TM6B, Tb[+]			BDSC # 6930
w[*]; Fmr1[Δ113M]/TM6B, Tb[1]			BDSC # 67403
MB247-GAL4 (Gaurav Das, NCCS Pune, India)			BDSC # 50742
LN1-GAL4			NP1227, NP consortium, Japan
row-shRNA			BDSC # 25971