ショウジョウバエにおけるトランスジェネシスのための胚マイクロインジェクション

要約

この記事では、ショウジョウバエのphiC31インテグラーゼ媒介トランスジェネシスを例に、トランスジェニックフライを作成するための重要なステップである胚マイクロインジェクションの最適化されたプロトコルを紹介します。

要約

ショウジョウバエのトランスジェネシスは、生物レベルで遺伝子機能を研究するための重要なアプローチです。胚マイクロインジェクションは、トランスジェニックフライの構築にとって重要なステップです。マイクロインジェクションには、マイクロインジェクター、マイクロマニピュレーター、倒立顕微鏡、実体顕微鏡など、いくつかの種類の機器が必要です。プラスミドミニプレップキットで単離されたプラスミドは、マイクロインジェクションに適しています。核が共通の細胞質を共有する前胚盤葉期または合胞体胚盤葉期の胚は、マイクロインジェクションを受けます。細胞ストレーナーは、胚の解体プロセスを容易にします。胚の解体と乾燥の最適な時期は、実験的に決定する必要があります。胚マイクロインジェクションの効率を高めるためには、プーラーで調製した針をニードルグラインダーで面取りする必要があります。針を研削する工程では、針先の毛細管現象を避けるために、圧力計付きのフットエアポンプを利用します。各プラスミドに対して120〜140個の胚を定期的に注入し、プラスミドの約85%に対して少なくとも1つのトランスジェニックラインを取得します。この記事では、ショウジョウバエのphiC31インテグラーゼ媒介トランスジェネシスを例にとり、ショウジョウバエのトランスジェネシスのための胚マイクロインジェクションの詳細なプロトコルを紹介します。

概要

ショウジョウバエDrosophila melanogasterは、遺伝子操作と遺伝子分析に非常に適しています。トランスジェニックショウジョウバエは、生物学研究で広く使用されています。1980年代初頭に開発されて以来、P-elementトランスポゾンを介したトランスジェネシスはショウジョウバエの研究に不可欠でした¹。いくつかのシナリオでは、piggyBacやMinosなどの他のトランスポゾンがショウジョウバエのトランスジェネシスにも使用されています²。トランスポゾンを介した導入遺伝子は、ショウジョウバエのゲノムにランダムに挿入され、異なるゲノム遺伝子座における導入遺伝子の発現レベルは位置効果により異なる場合があり、したがって比較することはできません²。これらの欠点は、phiC31を介した部位特異的トランスジェネシス³によって克服されました3。バクテリオファージphiC31遺伝子は、ショウジョウバエ³のattB部位とattP部位間の配列特異的な組換えを媒介するインテグラーゼをコードしています。多くのattPドッキングサイトが特徴付けられており、ブルーミントンショウジョウバエストックセンター3,4,5,6,7,8,9で利用できます。

ショウジョウバエのphiC31トランスジェネシスシステムは、ハエコミュニティで広く使用されています。attPドッキング部位のうち、X染色体上のattP18、第2染色体上のattP40、および第3染色体上のattP2は、通常、各染色体上の導入遺伝子統合に適した部位です。なぜなら、3つの部位の導入遺伝子は、基礎発現のレベルが低い一方で、誘導可能な発現のレベルが高いためです⁵。しかし最近、van der Graafらは、Msp300遺伝子座に近いattP40部位とattP40に統合された導入遺伝子が、ショウジョウバエ¹⁰の幼虫の筋核クラスタリングを引き起こすことを発見しました。最近の別の研究では、Duan氏らは、ホモ接合型のattP40染色体が、ショウジョウバエ¹¹のOr47b嗅覚受容体ニューロンクラスの正常な糸球体組織を破壊することを発見しました。これらの知見は、実験を設計し、データを解釈する際には、厳密な管理を含めるべきであることを示唆している。

ショウジョウバエは、ライフサイクルが短く、低コストで、メンテナンスが容易なため、遺伝子機能のin vivo調査に理想的なモデル生物です。ゲノムワイドな遺伝子スクリーニングは、ショウジョウバエ^12,13,14,15のゲノムワイドなトランスジェニックライブラリーの構築に依存しています。私たちはこれまでに、Drosophila Genomics Resource Center(DGRC)Gold Collection¹⁶でヒトに保存されているショウジョウバエ遺伝子の83%をカバーする、バイナリGAL4/upstream activating sequence(GAL4/UAS)システムに基づく5551のUAS-cDNA/ORFコンストラクトを生成しました。UAS-cDNA/ORFプラスミドは、ショウジョウバエのトランスジェニックUAS-cDNA/ORFライブラリーの作成に使用できます。効率的な胚マイクロインジェクション技術は、トランスジェニックフライライブラリの作成を加速することができます。

胚マイクロインジェクションの場合、針先は通常、カバースリップ¹⁷に対して折れている。そのため、針が詰まったり、細胞質が大量に漏れたりすることが多く、これらの問題が発生した場合には、新たな針を用いなければなりません。面取り針はマイクロインジェクションの効率を高めることができますが、研削プロセス中に研削液が面取りされた先端に入ります。斜めの先端の粉砕液は、自然にすぐには蒸発しません。そのため、面取り直後のマイクロインジェクションには針を利用できません。 これらの要因は、胚マイクロインジェクション手順の効率を低下させます。ここでは、 ショウジョウバエ におけるphiC31を介した部位特異的トランスジェネシスを例に、 ショウジョウバエにおけるトランスジェネシスのための胚マイクロインジェクションのプロトコールを提示する。研削液が針に入らないように、エアポンプで針内に空気圧をかけることで、面取りした先端に研削液が入らないようにしています。面取りされた針は、面取り後すぐにサンプルのローディングとマイクロインジェクションの準備ができています。

プロトコル

1. プラスミドの調製

1. プラスミドミニプレップキットを使用して、4 mLの一晩の細菌培養物からプラスミドを単離します。40 μLの溶出バッファーで溶出します。
   注:プラスミドmidi-prepキットを使用したプラスミドの単離は必要ありません。プラスミドミニプレップキットは、胚マイクロインジェクションの実験要件を完全に満たすことができます。このプロトコールでは、調製したUAS-cDNA/ORFプラスミドには、UASの10個のコピー、Hsp70最小プロモーター、attB部位、ミニホワイト遺伝子、および目的の遺伝子が含まれています。
2. 分光光度計を使用してプラスミドDNA濃度を測定し、-80°Cの冷凍庫で保存します。
   注:ショウジョウバエのトランスジェネシスには20 ng/μLから1683 ng/μLの範囲のプラスミド濃度が良好に機能するため、プラスミド濃度は胚マイクロインジェクションの成功にとって重要ではありません。
3. マイクロインジェクションの直前に、プラスミドを解凍し、13000 x g で5分間遠心分離します。
4. 各プラスミド10 μLを液体の上層から新しい1.5 mLチューブに移します。

2.針を引く

1. 選択した設定(熱:500、プル:50、ベル:60、遅延:90、圧力:200、ランプテスト:510)でニードルプーラーをオンにします。
2. ホウケイ酸ガラスキャピラリー(外径1.0mm、内径0.75mm、長さ10cm)をニードルプーラーに挿入し、フタを閉めます。
3. プルボタンを押します。各ガラスキャピラリーは2本の針を作ります。

3.研削針(図1)

1. ニードルグラインダーの適切な研磨板(先端サイズ0.7〜2.0μm用)を取り付けたニードルグラインダーをご使用ください。
2. 布(基準線)を粉砕液(蒸留水100mL、NaCl0.9g、湿潤剤1mL)で濡らし、布を固定します。
3. ニードルグラインダーの電源を入れ、グラインディングプレートを回転させ続けます。
4. 圧力計付きのフットエアポンプにシリコンキャピラリーチューブを介して針を接続し、針をニードルグラインダーの針ホルダーに取り付けます。研削プレートに対する針の角度を35°に調整します(図1A、B)。
5. 顕微鏡の下にある粗いコントロールノブを使用して、針先の位置を研削プレート表面のすぐ上に配置します(図1C)。
   注:セクション2で得られた引っ張られた針は、プーラーのユーザーマニュアルに記載されているように、6〜8mmのテーパーと1μm未満の先端(図1D)を備えています。
6. フットエアポンプを使用して、針の内部圧力を40psiに保ちます。顕微鏡下の細かいコントロールノブで針先の位置を調整し、針先が研削板に触れるようにします。
7. 3〜5秒間挽きます。針先から小さな気泡が出てきたら、針を降ろします(図1E)。
   注:研削の過程で、エアポンプを使用すると、粉砕液が吸い上げられるのを防ぎます。
8. 挽いた針を収納ケースに入れます。
   注:挽いた針は、マイクロインジェクションの少なくとも数週間前に保管ケースに保管できますが、できるだけ挽きたての針を使用してください。

4. プラスミドをロードするためのピペットの準備

1. 200μLのピペットをアルコールバーナーの外炎で加熱します。
2. 溶け始めたら、ピペットを伸ばします。
3. 伸ばしたピペットの密封された端をハサミで切り取り、伸ばしたピペットをDNAをグランドニードルにロードする準備が整います。
   注:あるいは、粉砕針を充填するための非常に長くて細い先端が市販されています。
4. これらのピペットをオートクレーブ処理されたプラスチックの箱に入れます。

5.胚の収集

1. 50バイアルから孵化させてから3日後に、phiC31インテグラーゼを発現し、attP2ドッキング部位を支えているハエ(vas-phiC31; + ; attP2)を収集し、ケージ(φ 90 mm x 150 mm)に移します。各ぶどう寒天プレート¹⁸の中央に少し新鮮な酵母ペーストを追加します。
2. ハエのケージを2〜4個用意します。ケージとプレートを25°Cに保ち、プレートを2〜4日間毎日交換します。
   注:この研究では、第1染色体上のvas-phiC31導入遺伝子(ストック#36313、ブルーミントン ショウジョウバ エストックセンター)と第3染色体上のattP2導入遺伝子(ストック#36313、ブルーミントン ショウジョウ バエストックセンター)を組み合わせました。得られたストック(vas-phiC31;+;attP2)をこのプロトコールで使用します。イーストペーストは毎日準備する必要があり、新鮮なイーストペーストをハエに供給する必要があります。交換されたケージは、ケージに残っている胚を取り除くために、クリアして乾燥させる必要があります。
3. マイクロインジェクションの日は、午前中にケージとプレートを交換してください。次に、30分ごとにプレートを交換し、これらのプレートから胚を採取します。すべてのケージとプレートを室温(RT)で交換し、その後、ケージとプレートを25°Cに保ちます。
   注:一部のプロトコルでは、産卵のためにケージとプレートを18°Cでインキュベートすることを好みます。それは、マイクロインジェクションに必要な胚の数によります。

6.胚の脱葉

1. 60 mLの漂白剤(活性塩素含有量34〜46 g / Lを含む)と140 mLの二重蒸留水を混合して、30%の漂白剤を調製します。
2. グレープジュース寒天プレートに残ったハエをブラシまたは鉗子で取り除き、胚を二重蒸留水で細胞ストレーナーにすすぎます。
3. 胚を含む細胞ストレーナーをティッシュペーパーで乾かします。
4. 漂白剤を30%含んだシャーレに入れ、セルストレーナーを手または水平シェーカーで60rpmで1.5分間渦巻かせます。
   注:すすぎは重要なステップです。すすぎ時間が十分に長くないと、胚の殻は完全にはがれません。すすぎ時間が長すぎると、胚が柔らかくなり、壊れやすくなります。セルストレーナーは、30%漂白剤に完全に浸す必要があります。漂白剤による怪我を避けるために、ゴム手袋と白衣を着用してください。
5. 実験室のプラスチック洗浄ボトルに保存した二重蒸留水で胚を2分間すすぎ、残留漂白剤を取り除きます。ラインナップの浮遊胚を選択します。

7. 胚の整列

1. 固形のブドウジュース寒天を刃を使って長いストリップに切ります。
   注:紫色のブドウジュースを使用して、白い胚を並べやすくします。
2. 絵筆を使用して胚を長いストリップに移します。
3. 約60個の胚を、長いストリップの端に沿って解剖針で並べ、後部をストリップの外側に向けています。5分以内に約60個の胚を並べます。
   注:マイクロパイルは、胚の前極にある円錐形の突起であり、精子はそれを通して卵子を受精するために入ります(図2A)。したがって、胚の前極にある円錐形の突起に基づいて、脱葉された胚の後部を決定することは容易である。
4. カバースリップ(18 mm x 18 mm)の端に沿って縦に18 mmの両面テープを貼り、紙の裏紙を取り除きます。カバースリップを整列した胚にそっと押し付けます。胚がテープの中央に接着されていることを確認します。

8.乾燥胚

1. 胚を並べたカバースリップを乾燥剤の入った箱に入れます。乾燥時間は温度や湿度により異なります。
   注:乾燥時間はマイクロインジェクションにとって重要であり、実験的に決定する必要があります。乾燥時間は通常、夏は9〜10分、冬は17〜18分です。
2. 胚をハロカーボンオイルで覆います。
   注:余分な油が接着剤からオーバーフローする可能性があるため、胚に油を落としすぎないでください。ハロカーボンオイル700とハロカーボンオイル27の体積比は1:3です。

9. 胚のマイクロインジェクション

1. 伸ばしたピペットを使用して、2 μLのDNAを針にロードします。針に気泡がないことを確認してください。針をマイクロマニピュレーターのニードルホルダーに入れます。
2. ハロカーボンオイルで覆われた整列した胚を倒立顕微鏡下に置きます。胚の後端が針を向いていることを確認してください。
3. マイクロマニピュレーターを使用して、針を胚に近づけます。針を片付けます。針から出ている液体の滴が見えていることを確認します。300 hPaの注入圧力と20 hPaの平衡圧力から始めて、注入の圧力と平衡の圧力を調整して、液体の液滴の最適なサイズを確保します。
4. マイクロマニピュレーターを使用して針を胚の後端に挿入し、マイクロインジェクターに接続されたフットコントロールを使用してDNAを注入します(図2)。小さなハローが見える場合、DNAは胚に正常に注入されます。
   注:注射用の多核胚を選択し、「クリーン」ボタンを使用して古い胚を殺します。注入後に大量の細胞質が漏れると、胚の乾燥が不十分になります。注射後に少量の細胞質が漏れるか、まったく漏れない場合、注射は成功したと見なされます。注入後に胚の3分の1以上が細胞質を漏出する場合は、乾燥時間を1〜2分延長します。胚の3分の1以上が過度に乾燥している場合は、乾燥時間を1〜2分短縮します。
5. 胚から針を取り出します。針を次の胚の後端に移動します。上記の手順を繰り返します。
6. 注入した胚を寒天プレートに入れます。プレートを18〜20°Cの部屋に置きます。 翌日、プレートを25°C温度、湿度50〜60%のインキュベーターに移し、1日間インキュベートします。
   注:注入後、胚を18〜20°Cの温度に保ち、胚の発育を遅らせ、プラスミドDNAの ショウジョ ウバエゲノムへの統合を促進し、注入した胚の生存率を高めます。

10.幼虫の収集

1. 解剖針を使用して、バイアル内の食品をこすり落とし、ほぐします。数滴の蒸留水を食品に供給します。
   注意: 幼虫が溺れるのを防ぐために、蒸留水を食品に吸収させます。
2. インキュベーターからプレートを取り出します。
3. 孵化した幼虫を実体顕微鏡下の絵筆で収集し、バイアルに移します。
4. バイアルを25°Cの温度と50%〜60%の湿度でインキュベーターに入れます。

11. トランスジェニックフライの入手

1. バイアルを25°Cで10日間インキュベートした後、孵化したハエを採取。
2. 1匹のオスフライをTM2/TM6C Sb¹ Tb¹ バランサーの3匹のメスフライに交配し、1匹のメスフライをTM2/TM6C Sb¹ Tb¹ バランサーの3匹のオスフライに交配します。
3. クロスを25°Cの温度と50%〜60%の湿度のインキュベーターに入れます。
4. オレンジ色の目をしたハエの子孫を選別します。これらはトランスジェニックフライです(図3A-C)。
   注:attP2ドッキング部位で導入遺伝子のコピーを持つハエは、オレンジ色の目をしています。
5. 1匹のオレンジ色の目のオスのフライをTM2 / TM6C Sb¹ Tb¹ バランサーの3匹の処女のメスのフライに交差させて、ストックを確立します。
   注:最初の染色体上のphiC31導入遺伝子をクロスアウトするためには、複数の世代のクロスを設定する必要があります。

結果

注射針の先端は、ニードルグラインダーによって面取りされます(図1)。1時間で50〜60本の針を面取りできます。DNAは、核が共通の細胞質を共有する胚盤葉前胚盤葉または合胞体胚盤葉期で胚の後部にマイクロインジェクションされます(図2A)。胚の後部は、胚の前方にあるマイクロパイルに基づいて容易に位置を特定できます(図2A

ディスカッション

ここでは、 ショウジョウバエのトランスジェネシスのための胚マイクロインジェクションのプロトコルを紹介します。phiC31を介した部位特異的トランスジェネシスについては、各プラスミドに対して120〜140個の胚を注入し、プラスミドの約85%に対して少なくとも1つのトランスジェニックラインを取得しました(補足表2)。私たちの経験では、ショ ウジョウバエのト?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 μm Cell Strainer	NEST	258367
3M double-sided adhesive	3M	415
Borosilicate glass	SUTTER	B100-75-10
Diamond abrasive plate	SUTTER	104E
FLAMING/BROWN Micropipette Puller	SUTTER	P-1000
Foot air pump with pressure gauge	Shenfeng	SF8705D
Halocarbon oil 27	Sigma	H8773
Halocarbon oil 700	Sigma	H8898
Inverted microscope	Nikon	ECLIPSE Ts2R
Microinjection pump	eppendorf	FemtoJet 4i
Micromanipulator	eppendorf	TransferMan 4r
Micropipette Beveler	SUTTER	BV-10
Microscope cover glasses (18 mm x 18 mm)	CITOLAS	10211818C
Microscope slides (25 mm x 75 mm)	CITOLAS	188105W
Petri dish (90 mm x 15 mm)	LAIBOER	4190152
Photo-Flo 200	Kodak	1026269
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
Stereo Microscope	Nikon	SMZ745