ショウジョウバエにおけるトランスジェネシスのための胚マイクロインジェクション

要約

この記事では、ショウジョウバエのphiC31インテグラーゼ媒介トランスジェネシスを例に、トランスジェニックフライを作成するための重要なステップである胚マイクロインジェクションの最適化されたプロトコルを紹介します。

要約

ショウジョウバエのトランスジェネシスは、生物レベルで遺伝子機能を研究するための重要なアプローチです。胚マイクロインジェクションは、トランスジェニックフライの構築にとって重要なステップです。マイクロインジェクションには、マイクロインジェクター、マイクロマニピュレーター、倒立顕微鏡、実体顕微鏡など、いくつかの種類の機器が必要です。プラスミドミニプレップキットで単離されたプラスミドは、マイクロインジェクションに適しています。核が共通の細胞質を共有する前胚盤葉期または合胞体胚盤葉期の胚は、マイクロインジェクションを受けます。細胞ストレーナーは、胚の解体プロセスを容易にします。胚の解体と乾燥の最適な時期は、実験的に決定する必要があります。胚マイクロインジェクションの効率を高めるためには、プーラーで調製した針をニードルグラインダーで面取りする必要があります。針を研削する工程では、針先の毛細管現象を避けるために、圧力計付きのフットエアポンプを利用します。各プラスミドに対して120〜140個の胚を定期的に注入し、プラスミドの約85%に対して少なくとも1つのトランスジェニックラインを取得します。この記事では、ショウジョウバエのphiC31インテグラーゼ媒介トランスジェネシスを例にとり、ショウジョウバエのトランスジェネシスのための胚マイクロインジェクションの詳細なプロトコルを紹介します。

概要

ショウジョウバエDrosophila melanogasterは、遺伝子操作と遺伝子分析に非常に適しています。トランスジェニックショウジョウバエは、生物学研究で広く使用されています。1980年代初頭に開発されて以来、P-elementトランスポゾンを介したトランスジェネシスはショウジョウバエの研究に不可欠でした¹。いくつかのシナリオでは、piggyBacやMinosなどの他のトランスポゾンがショウジョウバエのトランスジェネシスにも使用されています²。トランスポゾンを介した導入遺伝子は、ショウジョウバエのゲノムにランダムに挿入され、異なるゲノム遺伝子座における導入遺伝子の発現レベルは位置効果により異なる場合があり、したがって比較することはできません²。これらの欠点は、phiC31を介した部位特異的トランスジェネシス³によって克服されました3。バクテリオファージphiC31遺伝子は、ショウジョウバエ³のattB部位とattP部位間の配列特異的な組換えを媒介するインテグラーゼをコードしています。多くのattPドッキングサイトが特徴付けられており、ブルーミントンショウジョウバエストックセンター3,....

プロトコル

1. プラスミドの調製

1. プラスミドミニプレップキットを使用して、4 mLの一晩の細菌培養物からプラスミドを単離します。40 μLの溶出バッファーで溶出します。
   注:プラスミドmidi-prepキットを使用したプラスミドの単離は必要ありません。プラスミドミニプレップキットは、胚マイクロインジェクションの実験要件を完全に満たすことができます。このプロトコールでは、調製したUAS-cDNA/ORFプラスミドには、UASの10個のコピー、Hsp70最小プロモーター、attB部位、ミニホワイト遺伝子、および目的の遺伝子が含まれています。
2. 分光光度計を使用してプラスミドDNA濃度を測定し、-80°Cの冷凍庫で保存します。
   注:ショウジョウバエのトランスジェネシスには20 ng/μLから1683 ng/μLの範囲のプラスミド濃度が良好に機能するため、プラスミド濃度は胚マイクロインジェクションの成功にとって重要ではありません。
3. マイクロインジェクションの直前に、プラスミドを解凍し、13000 x g で5分間遠心分離します。
4. 各プラスミド10 μLを液体の上層から新しい1.5 mLチューブに移します。

2.針を引く

1. 選択した設定(熱:....

ディスカッション

ここでは、 ショウジョウバエのトランスジェネシスのための胚マイクロインジェクションのプロトコルを紹介します。phiC31を介した部位特異的トランスジェネシスについては、各プラスミドに対して120〜140個の胚を注入し、プラスミドの約85%に対して少なくとも1つのトランスジェニックラインを取得しました(補足表2)。私たちの経験では、ショ ウジョウバエのト?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 μm Cell Strainer	NEST	258367
3M double-sided adhesive	3M	415
Borosilicate glass	SUTTER	B100-75-10
Diamond abrasive plate	SUTTER	104E
FLAMING/BROWN Micropipette Puller	SUTTER	P-1000
Foot air pump with pressure gauge	Shenfeng	SF8705D
Halocarbon oil 27	Sigma	H8773
Halocarbon oil 700	Sigma	H8898
Inverted microscope	Nikon	ECLIPSE Ts2R
Microinjection pump	eppendorf	FemtoJet 4i
Micromanipulator	eppendorf	TransferMan 4r
Micropipette Beveler	SUTTER	BV-10
Microscope cover glasses (18 mm x 18 mm)	CITOLAS	10211818C
Microscope slides (25 mm x 75 mm)	CITOLAS	188105W
Petri dish (90 mm x 15 mm)	LAIBOER	4190152
Photo-Flo 200	Kodak	1026269
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
Stereo Microscope	Nikon	SMZ745