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要約

ここでは、患者由来の腫瘍オルガノイドの電離放射線に対する感度を定量化するための簡単なライブイメージングアプローチについて詳しく説明します。

要約

放射線療法(RT)は、現代の臨床がん管理の主力の1つです。しかし、すべての種類のがんが放射線に対して等しく感受性があるわけではなく、多くの場合(常にではありませんが)、電離光線によって誘発される悪性細胞の酸化的DNA損傷を修復する能力の違いによるものです。クローノジェニックアッセイは、培養がん細胞の電離照射に対する感受性を評価するために何十年にもわたって採用されてきましたが、これは主に、照射されたがん細胞が遅延して死滅することが多く、短期のフローサイトメトリーまたは顕微鏡法による定量化が困難なためです。残念ながら、クローノジェニックアッセイは、患者由来腫瘍オルガノイド(PDTO)などのより複雑な腫瘍モデルには使用できません。実際、確立されたPDTOを放射線で照射しても、その幹様コンパートメントが完全に根絶されない限り、必ずしも多細胞単位としての成長が阻害されるわけではありません。さらに、PDTO由来の単一細胞懸濁液を照射すると、確立されたPDTOの状況で悪性細胞のRTに対する感受性を適切に再現できない場合があります。ここでは、確立されたPDTOを電離放射線に曝露し、その後、単一細胞解離、適切な培養条件での再プレーティング、およびライブイメージングを含む従来のクローン生成アッセイの適応について詳しく説明します。非照射(制御)PDTO由来幹様細胞は、PDTO特異的な効率で増殖するPDTOを改質しますが、これは線量依存的に照射によって悪影響を受けます。これらの条件では、制御PDTOが所定のスペース占有率を達成するまで収集されたタイムラプス画像の放射線感受性の尺度として、PDTO形成効率と成長率を定量化できます。

概要

外照射療法(RT)は、一般的に管理可能な副作用の明確なスペクトル1に関連する顕著な抗がん活性だけでなく、非常に広範な臨床利用可能性も反映しており、現代の腫瘍学の主力の1つです(先進国のほとんどのがんセンターには、外部ビームRT用の最新の線形加速器が装備されています)2.この考えに沿って、RTは、一般的には早期疾患の文脈における治癒目的3,4と、転移性腫瘍5からの症状(例えば、痛み)を封じ込めるための緩和的応用の両方において、世界的に成功裏に採用されている。とは言うものの、すべての悪性腫瘍がRTに対して等しく感受性があるわけではなく、これは多くのがん細胞内因性および微小環境の特徴を反映しています6,7,8,9。独立した例として、DNA修復および酸化還元恒常性に影響を与える様々ながん関連遺伝的およびエピジェネティックな変化は、内因性放射線感受性の増加または減....

プロトコル

この試験で使用された試薬および機器は、 材料表に記載されています。

1. オルガノイド培養

注: TNBC#1 PDTO は、トリプルネガティブ乳がん (TNBC) の患者から外科的に切除された腫瘍組織に基づいて、バイオバンキング プロトコル (IRB21-06023682) に参加するためのインフォームド コンセントを提供したことに基づいて、私たちの研究室で設立されました。組織学およびRNAシーケンシング(RNAseq)による検証後、TNBC#1 PDTOは、濃縮DMEM/F12培地(表1)中の66%マトリゲル滴(いわゆる「ドーム」)で培養され、2〜3週間ごとに1:2〜1:10の比率で継代されます28

  1. 照射の約2週間前に、PDTOを1:2-1:10の比率で、試験した放射線量ごとに1つずつ、別々の非接着性の6ウェルプレートに播種します(さらに、電離放射線に曝露されていないPDTOによって提供される陰性コントロール)。
  2. 3〜4日ごとに、3 mLの新鮮で濃縮されたDMEM/F12培地をPDTOに加えます。
    注:播種および培養条件は、PDTOが顕微鏡下でコア壊死を示....

結果

TNBC#1 PDTOは、0日目に0(未照射対照)、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy、または10 Gyの単回放射線量に被曝した。その直後、PDTOを解離して、各実験条件のシングルセル懸濁液を得ました。次に、PDTO由来の細胞を、ウェルの中央に堆積した66%マトリゲルドーム(各50μL)内の48ウェルプレートに、条件ごとに3回のテクニカルレプリケートで播種しました。プレートをライブイメージングシ.......

ディスカッション

ここでは、乳がんのPDTOとライブイメージングを利用して、(1)in vitroでのPDTO照射によるPTDO形成幹様細胞の持続性、および(2)これらの細胞が生成する(可能性のある)PDTOの増殖速度に基づいてPDTO放射線感受性を定量化する従来のクローン生成アッセイの適応について説明します。このプロトコルの重要なステップには、(1)良好な生存率を可能にするドーム占有への.......

開示事項

本研究とは無関係に、SCFは、メルク、バリアン、ブリストル・マイヤーズ スクイブ、セルデックス、リジェネロン、エーザイ、イーライリリーと研究契約を結んでおり、バイエル、ブリストル マイヤーズ スクイブ、バリアン、エレクタ、リジェネロン、エーザイ、アストラゼネカ、メディミューン、メルク米国、EMDセローノ、アキュレイ、ベーリンガーインゲルハイム、ロシュ、ジェネンテック、アストラゼネカ、ビュー・レイ、ナノビオティクスから研究契約を結んでいます。この仕事とは無関係に、SDはLytix Biopharma、EMD Serono、小野薬品工業、Genentech、Johnson & Johnson Enterprise Innovation Inc.からコンサルティング/アドバイザリーの謝礼を受けており、Lytix Biopharma、Nanobiotix、Boehringer-Ingelheimと研究契約を結んでいます。この仕事とは無関係に、LGはLytix Biopharma、Promontory、Onxeoと研究契約を結んでおり、Boehringer Ingelheim、AstraZeneca、OmniSEQ、Onxeo、The Longevity Labs、Inzen、Imvax、Sotio、Promontory、Noxopharm、EduCom、Luke Heller TECPR2 Foundationからコンサルティング/アドバイザリーの謝礼を受け取っています。

謝辞

このプロトコルの開発に協力してくれたRaymond Briones氏とWen H. Shen氏(Weill Cornell Medical College、New York、NY、USA)に感謝します。この研究は、米国国防総省BCRP(#W81XWH2120034、PI:Formenti)からのTransformative Breast Cancer Consortium Grantによってサポートされています。

....

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
40 µm mesh filterThomas Scientific1164H35
B27Invitrogen17504-044
Cellometer Auto T4 Bright Field Cell CounterNexcelom
DMEM F/12Corning 12634-010
Epidermal Growth Factor hEGFPeprotechAF-100-15
EVOS FL Digital Inverted Fluorescence Microscope Thermo Fisher Scientific12-563-460
FGF10Peprotech100-26
FGF7Peprotech 100-19
GlutaMaxInvitrogen 35050061
HepesInvitrogen 15630-080
IncuCyte software 2021ASartoriusversion: 2021A
Incucyte SX1Sartoriusmodel SX1
Incucyte validated 48 well plateCorning 3548
MatrigelDiscovery Labware354230
nAcSigma Aldrich A9165-5G
NicotinamideSigma-AldrichN0636
NogginPurchased from the Englander Institute for Precision Medicine, Weill Cornell, NY, USA
Non-treated 6 well plateCellstar657 185
NR (Heregulin)Peprotech100-03
p38 MAP inhibitor p38i SB202190Sigma Aldrich S7067
PBSCorning 21-040-CV
PenStrepInvitrogen15140-122
PrimocinInvivogenant-pm-1
Rspondin MediaPurchased from the Englander Institute for Precision Medicine, Weill Cornell, NY, USA
Small Animal Radiation Research Platform (SARRP) Xstrahl Ltd
TGFbeta Receptor Inhibitor A83-01Tocris2939
Trypan blue Stain (0.4%)Gibco15250-61
TrypLEGibco112605-028
Y-27632 (RhoKi)SelleckS1049

参考文献

  1. De Ruysscher, D., et al. Radiotherapy toxicity. Nat Rev Dis Primers. 5 (1), 13 (2019).
  2. Bates, J. E., Sanders, T., Arnone, A., Elmore, S. N. C., Royce, T. J. Geographic density of linear accelerators and receipt of radiation therapy for ....

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