患者由来腫瘍オルガノイドの細胞放射線感受性を定量化するためのライブイメージング

要約

ここでは、患者由来の腫瘍オルガノイドの電離放射線に対する感度を定量化するための簡単なライブイメージングアプローチについて詳しく説明します。

要約

放射線療法(RT)は、現代の臨床がん管理の主力の1つです。しかし、すべての種類のがんが放射線に対して等しく感受性があるわけではなく、多くの場合(常にではありませんが)、電離光線によって誘発される悪性細胞の酸化的DNA損傷を修復する能力の違いによるものです。クローノジェニックアッセイは、培養がん細胞の電離照射に対する感受性を評価するために何十年にもわたって採用されてきましたが、これは主に、照射されたがん細胞が遅延して死滅することが多く、短期のフローサイトメトリーまたは顕微鏡法による定量化が困難なためです。残念ながら、クローノジェニックアッセイは、患者由来腫瘍オルガノイド(PDTO)などのより複雑な腫瘍モデルには使用できません。実際、確立されたPDTOを放射線で照射しても、その幹様コンパートメントが完全に根絶されない限り、必ずしも多細胞単位としての成長が阻害されるわけではありません。さらに、PDTO由来の単一細胞懸濁液を照射すると、確立されたPDTOの状況で悪性細胞のRTに対する感受性を適切に再現できない場合があります。ここでは、確立されたPDTOを電離放射線に曝露し、その後、単一細胞解離、適切な培養条件での再プレーティング、およびライブイメージングを含む従来のクローン生成アッセイの適応について詳しく説明します。非照射(制御)PDTO由来幹様細胞は、PDTO特異的な効率で増殖するPDTOを改質しますが、これは線量依存的に照射によって悪影響を受けます。これらの条件では、制御PDTOが所定のスペース占有率を達成するまで収集されたタイムラプス画像の放射線感受性の尺度として、PDTO形成効率と成長率を定量化できます。

概要

外照射療法(RT)は、一般的に管理可能な副作用の明確なスペクトル1に関連する顕著な抗がん活性^{だけでなく、非常に}広範な臨床利用可能性も反映しており、現代の腫瘍学の主力の1つです(先進国のほとんどのがんセンターには、外部ビームRT用の最新の線形加速器が装備されています)².この考えに沿って、RTは、一般的には早期疾患の文脈における治癒目的^3,4と、転移性腫瘍5からの症状(例えば、痛み)を封じ込めるための緩和的応用の両方において、世界的に成功裏に採用^{されている。}とは言うものの、すべての悪性腫瘍がRTに対して等しく感受性があるわけではなく、これは多くのがん細胞内因性および微小環境の特徴を反映しています6,7,8,9。独立した例として、DNA修復および酸化還元恒常性に影響を与える様々ながん関連遺伝的およびエピジェネティックな変化は、内因性放射線感受性の増加または減....

プロトコル

この試験で使用された試薬および機器は、 材料表に記載されています。

1. オルガノイド培養

注: TNBC#1 PDTO は、トリプルネガティブ乳がん (TNBC) の患者から外科的に切除された腫瘍組織に基づいて、バイオバンキング プロトコル (IRB21-06023682) に参加するためのインフォームド コンセントを提供したことに基づいて、私たちの研究室で設立されました。組織学およびRNAシーケンシング(RNAseq)による検証後、TNBC#1 PDTOは、濃縮DMEM/F12培地(表1)中の66%マトリゲル滴(いわゆる「ドーム」)で培養され、2〜3週間ごとに1:2〜1:10の比率で継代されます²⁸。

1. 照射の約2週間前に、PDTOを1:2-1:10の比率で、試験した放射線量ごとに1つずつ、別々の非接着性の6ウェルプレートに播種します(さらに、電離放射線に曝露されていないPDTOによって提供される陰性コントロール)。
2. 3〜4日ごとに、3 mLの新鮮で濃縮されたDMEM/F12培地をPDTOに加えます。
   注:播種および培養条件は、PDTOが顕微鏡下でコア壊死を示....

結果

TNBC#1 PDTOは、0日目に0(未照射対照)、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy、または10 Gyの単回放射線量に被曝した。その直後、PDTOを解離して、各実験条件のシングルセル懸濁液を得ました。次に、PDTO由来の細胞を、ウェルの中央に堆積した66%マトリゲルドーム(各50μL)内の48ウェルプレートに、条件ごとに3回のテクニカルレプリケートで播種しました。プレートをライブイメージングシ.......

ディスカッション

ここでは、乳がんのPDTOとライブイメージングを利用して、(1)in vitroでのPDTO照射によるPTDO形成幹様細胞の持続性、および(2)これらの細胞が生成する(可能性のある)PDTOの増殖速度に基づいてPDTO放射線感受性を定量化する従来のクローン生成アッセイの適応について説明します。このプロトコルの重要なステップには、(1)良好な生存率を可能にするドーム占有への.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 µm mesh filter	Thomas Scientific	1164H35
B27	Invitrogen	17504-044
Cellometer Auto T4 Bright Field Cell Counter	Nexcelom
DMEM F/12	Corning	12634-010
Epidermal Growth Factor hEGF	Peprotech	AF-100-15
EVOS FL Digital Inverted Fluorescence Microscope	Thermo Fisher Scientific	12-563-460
FGF10	Peprotech	100-26
FGF7	Peprotech	100-19
GlutaMax	Invitrogen	35050061
Hepes	Invitrogen	15630-080
IncuCyte software 2021A	Sartorius		version: 2021A
Incucyte SX1	Sartorius		model SX1
Incucyte validated 48 well plate	Corning	3548
Matrigel	Discovery Labware	354230
nAc	Sigma Aldrich	A9165-5G
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636
Noggin			Purchased from the Englander Institute for Precision Medicine, Weill Cornell, NY, USA
Non-treated 6 well plate	Cellstar	657 185
NR (Heregulin)	Peprotech	100-03
p38 MAP inhibitor p38i SB202190	Sigma Aldrich	S7067
PBS	Corning	21-040-CV
PenStrep	Invitrogen	15140-122
Primocin	Invivogen	ant-pm-1
Rspondin Media			Purchased from the Englander Institute for Precision Medicine, Weill Cornell, NY, USA
Small Animal Radiation Research Platform (SARRP)	Xstrahl Ltd
TGFbeta Receptor Inhibitor A83-01	Tocris	2939
Trypan blue Stain (0.4%)	Gibco	15250-61
TrypLE	Gibco	112605-028
Y-27632 (RhoKi)	Selleck	S1049