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要約

このプロトコルは、プロゲステロン/エストラジオールおよび絨毛性ゴナドトロピンのレベルを測定して卵巣周期の段階を決定するための血液および尿のサンプリングについて説明します。ホルモンレベルは排卵のタイミングを予測および決定するために使用され、ホルモンは卵巣周期と卵子の成長を調節するために注射されます。

要約

一般的なマーモセットは小さな新世界のサルです。マーモセットの生物学的メカニズムの多くはヒトと似ているため、マーモセットは神経科学、再生医療、開発など、さまざまな分野の医学研究やヒト生物学の研究に役立つ可能性があります。しかし、多くの基本的な実験や手順の方法を説明する文献は不足しています。ここでは、マーモセット中の性ホルモン(プロゲステロン、エストラジオール、および絨毛性ゴナドトロピン)のレベルを決定するための詳細な方法について説明します。これらのホルモンの測定により、マーモセットでは通常26〜30日である卵巣周期の段階を予測できます。正確な測定は、正しい時点で卵子/受精卵を捕獲し、遺伝子組み換えマーモセットを生成するための宿主雌の準備に不可欠です。

さらに、性ホルモンレベルの測定は、内分泌学、動物行動学、初期発生、および生殖生物学の研究に役立ちます。このプロトコルは、大腿静脈からの採血、ホルモン測定のための血漿の分離、尿と血漿を使用した絨毛性ゴナドトロピンレベルの測定、プロスタグランジンF2αアナログの注射を使用して卵巣周期をリセットして周期を短縮し同期する方法、および卵胞刺激ホルモンと絨毛性ゴナドトロピンを注射することにより卵胞の成長と排卵を促進する方法の詳細な説明を提供します。これらのプロトコルを使用して、卵子/受精卵のタイムリーな収集のために卵巣周期の段階を決定できます。

概要

一般的なマーモセット(Callithrix jacchus)は、人間と同様の多くの特徴を持つ小さな新世界サルであり、その卵巣周期の期間は26-30日です1,2。遺伝子組み換えマーモセットの初期発生と生成に関する研究では、卵巣周期の特定の段階で卵子と受精卵を採取する必要があります。したがって、病期の正確な決定は非常に重要であり、ホルモンのプロゲステロン(P4)とエストラジオール(E2)2,3の血中濃度を測定することによって推定できます。これらのホルモンは、着床に必要な子宮内膜の成長を促進します。P4は黄体から産生され、黄体は排卵直後に卵巣に形成されます。E2は、脳の視床下部-下垂体複合体からの卵胞刺激ホルモン(FSH)に応答して卵巣卵胞から分泌されます。E2レベルは、卵胞が成熟するにつれて増加し、排卵前にピークに達します3。E2レベルが高いと、ヒトでは視床下部-下垂体複合体を介して黄体形成ホルモン(LH)がパルス放出されます。このLHサージは排卵を誘発します。しかし、マーモセットでは、LH遺伝子は進化の過程で変性し、代わりにLHと同様の構造を持つ絨毛性ゴナドトロピン(CG)が下垂体から放出されることで排卵が誘発されます4,5。

卵巣周期はホルモン注射によって制御できます。ヒトのFSH注射は、卵巣のFSH受容体に作用し、エストロゲン合成と卵胞の成長を促進するために使用されます6。卵胞期の終わりにLHの代わりにヒトCG(hCG)を注射することは、ヒトの排卵を刺激するために使用されます7。CG注射は、妊娠初期にCGが黄体を刺激し、P4産生を増加させるため、ヒトの不妊症の治療にも使用されます。プロスタグランジンF2α(PGF2α)注射は卵巣周期をリセットします8。家畜では、PGF2α注射を使用して黄体期を短縮し、発情周期を同期させて生殖管理を行います。

マーモセットとヒトは生物学的なメカニズムが似ているため、理想的なモデル動物ですが、よく使われる多くの技術の基本的な方法を説明した文献が不足しています。採血は、最も頻繁に使用される手法の1つです9,10,11,12。しかし、初心者の方は静脈を見つけるのに苦労することがあります。したがって、この研究では、大腿静脈領域の解剖学的分析を実施しました。解剖学的観察に基づいて、このプロトコルでは、大腿骨三角形の近位領域を静脈穿刺の簡単な部位として紹介します。

プロトコル

マーモセットを用いたすべての方法は、高い倫理観と福祉基準を活用し、国立成育医療研究センターの動物施設管理委員会によって承認されました。ここで使用された動物は、1日あたり12時間の光で、シングルハウスまたはペアハウス(雌1匹と雄1匹)でした。

1.大腿静脈の採血

  1. 1mLのシリンジ(ショートタイプが使いやすい)を用意し、25Gの針をブレード面を上にして取り付けます。血液の詰まりを防ぐため、200 μLの原液ヘパリンナトリウム溶液をシリンジに引き込んでシリンジをヘパリン化します。シリンジを数回上下に引っ張って、シリンジの内側を均等にコーティングします。次に、シリンジからヘパリン溶液を排出します。
    注:新しいシリンジへの交換がしばしば必要になるため、いくつかの追加のヘパリン添加シリンジを準備します。
  2. 吸収性の綿棒とアルコール綿棒を準備します。調整可能なランプのスイッチを入れて、採血のためにマーモセットが置かれる領域を照らします。
  3. 市販の拘束装置(420 x 85 x 85 mm、 図1A)を準備します(詳細については 、資料の表 を参照)。マーモセットを装置にセットするには、マーモセットを固定するスポンジベルトで保持部を開きます。マーモセットを上向きに拘束装置に挿入します。
    注:マーモセットは通常、拘束装置で落ち着いているため、拘束順応やトレーニングの必要性がなくなる場合があります。
  4. マーモセットを捕まえる。マーモセットを円筒形部分に挿入します。スポンジベルトを押し下げて固定します。採血する脚をもう一方の脚の上に置きます(図1A)。利き手ではない手で脚を持ちます。中指と薬指を各脚の内側に置いて固定し、もう一方の指を各脚の外側に置いて固定します。
    注:マーモセットを捕獲するときは、バイトグローブをお勧めします。拘束装置がない場合は、麻酔下で、またはマーモセットを拘束している他の人と一緒に採血してください。
  5. 大腿骨静脈が大腿部の付け根近くに見えるかどうかを確認します。そうでない場合は、触診して脈動する動脈を見つけ、それを目印として使用して、静脈がその中を走っていることを確認します(図1B-D)。
    注意: 視認性を向上させるために、デスクの照明とヘアシェービングをお勧めします。アルコール綿棒でこすることでも視認性が向上します。三角形のリンパ節は、静脈の近くに位置することが多く、静脈として濃い青色を示します。これらを区別する方法については、代表的な結果のセクションで説明します。
  6. アルコール綿棒を使用して穿刺部位を消毒します。針身の刃を上にして15°〜20°の角度で挿入します。採血時に針が血管から滑り落ちないように、注射器を持っている手をもう一方の手で休ませるなどして安定させます。
  7. プランジャーをゆっくりと引き戻して、負圧を加えます(図1E)。針先を前方に押します。血液がシリンジに入ったら、必要な量(500〜700μL)が収集されるまで針先の位置を維持します。
    1. 血液が注射器に入らない場合は、穿刺部位を変更してください。針を抜くときに血液が出てきた場合は、穿刺部位に3分間圧力をかけて止血します。出血が止まった後、静脈穿刺を再開します。
    2. シリンジに引き込まれる血液がドローイングプロセス中に流れなくなった場合は、針先をゆっくりと前方に押してから、後ろに引いて血管を見つけます。これにより、注射器への血液の流れが回復する可能性があります。そうでない場合は、針を引き出し、新しい注射器を使用して静脈穿刺を行います。
      注意: 同じ側から血液を採取するのが難しい場合は、もう一方の脚の太ももを使用してください。
  8. 小指を使って穿刺部位を軽く押しながら、丁寧に針を引き抜きます。次に、吸収性の綿棒を使用して、すぐに穿刺部位に3分間圧力をかけ、出血を止めます。シリンジを反転させて血液とヘパリンを混合します。
    注:動脈血を採取するときは、冷却しながら長時間(5分間)圧力をかけ、出血の経過を注意深く確認して、致命的な結果につながる可能性のある血腫の形成を防ぎます。
  9. 出血が止まったことを確認したら、スポンジベルトを外し、片手で動物の腰をつかみ、もう片方の手で動物の脇の下を背側から持てるように回転させます。
  10. マーモセットをケージに戻します。ストレスを軽減し、採血の繰り返しを容易にするために、マーモセットに好きな食べ物(ビスケット、マシュマロ、スポンジケーキなど)を提供します。血腫の発生状況を時々確認してください。
    注:初期段階で血腫が見つかった場合は、血腫の進行を防ぐために圧迫包帯を貼ってください。久しぶりに発見された場合、大腿動脈の結紮による血腫の外科的切除と輸血が必要になることがあります9,13。
  11. 溶血を防ぐために、針をシリンジから取り外します。次に、収集した血液を1.5mLのマイクロチューブの内壁に沿ってゆっくりと排出します。
    注:収集した血液は、P4 / E2レベルを測定するために、血漿分離の前に最大24時間4 °Cで保存できます。

2. 血漿の分離とホルモンレベルの測定

  1. 1.5 mLチューブ内の血液を1,100 × g で4 °Cで5分間遠心分離します。
  2. 分離した血漿(上清)を1.5 mLチューブから新しいチューブ/カップに移し、血球(沈殿物)の混入を慎重に避けます。.
  3. ELISAキットまたは自動アナライザを使用して、P4およびE2レベルを測定します。自動分析装置に血漿量が足りない場合は、試料希釈液を使用してください。
    注:自動分析装置を使用した測定では、P4レベルのみを決定するために>175μLの血漿が必要であり、P4とE2の両方を決定するには>250μLの血漿が必要です。

3. 排卵・妊娠を検出するための尿CG測定

注:マーモセットのCGレベルは、排卵と妊娠の両方について、イムノクロマトグラフィーキットテストを使用して測定できます。排卵の場合、排卵の0〜2日前に陽性の結果を得ることができます。妊娠の場合、妊娠15〜20日目から約100日目に陽性の結果が検出されます。この検査には少量(90μL)の尿が必要です(1滴の尿は~30μLです)。

  1. トレー方式:同じケージに2匹以上いる場合は、前日に対象のマーモセット(または他の動物)を別のケージに移動させます。照明の前夜または照明の前に、ケージの底に清潔なトレイを置きます。夜間は膀胱から尿が排出されません。したがって、尿は通常、照明直後に膀胱から放出されます。
    注:朝、照明が点灯する前の部屋に入ると、コホートの睡眠サイクルが乱れる可能性があります。通常、点灯後約30分以内に尿を採取できます。
  2. 圧搾方法:洗浄したトレイを採尿用に準備します。マーモセットの膀胱の位置を特定したら、指の全長を使用して、前面と両側から慎重に絞ります(図1F)。朝、部屋を照らす直前に尿を溜めてください。
    注:膀胱に尿がないために尿の収集が失敗した場合は、しばらく待ってから再試行してください。無理な力を加えると動物を傷つける恐れがありますので、ご注意ください。
  3. 採取後すぐに、尿サンプルをイムノクロマトグラフィーテストキットのウェルに入れます。製造元の指示に従って、10分後に結果を読み取ります。

4.卵子、受精卵、および胚の収集のための卵巣周期段階の制御と決定

  1. 卵巣からの胚小胞(GV)卵子の採取
    1. 150 μLの生理食塩水14 (図2)で希釈した0.263 mg / mLクロプロステノール(合成PGF2α類似体)を3 μLの筋肉内注射を行い、黄体期の終わり(つまり、黄体期の開始から≥10日後)に卵巣周期をリセットします。.
      注:希釈したクロプロステノールは、少なくとも+4°Cで数週間安定しているため、希釈溶液をより大きな量にすると便利な場合があります。
    2. 翌日(1日目)に、P4レベルが低下したことを確認して、卵胞期の開始を確認します。
      注:クロプロステノール注射は、24時間3以内にP4レベル(通常は<10 ng / mL)を劇的に減少させることが報告されています。.
    3. 1日目から、FSH(25 IU、筋肉内)を2日ごとに1回、合計5回(1、3、5、7、9日目)注入します。10日目は、午後にhCG(75 IU、筋肉内)を注射します。
    4. 文献15,16 によれば、麻酔下での卵胞吸引により、11 日目に卵巣から GV を収集します。
      注:時々、排卵は予想よりも早く起こります。したがって、8日目からCGレベルを確認することをお勧めします。重心検査が陽性の場合は、この日にGV採取を行ってください。
  2. 中期II(MII)卵子、受精卵、および初期胚の収集
    1. ステップ4.1.1で説明されているように、クロプロステノールを使用して卵巣周期をリセットします。.
    2. 翌日(1日目)に、P4レベルが低下したことを確認して、卵胞期の開始を確認します。
    3. 受精卵と胚の採集は、6日目から交尾のために雌のマーモセットと雄のマーモセットを一緒に飼育します。
    4. 7日目から、女性の血中P4 / E2レベルと尿CGレベルを確認します。重心の検出は、数日以内(通常は翌日)の排卵の指標です。前日と比較してP4レベルが増加し、E2レベルが減少した日に、卵管17,18からMII卵子または胚0日目(E0)接合子を採取する。
    5. 胚収集については、文献に記載されているように、卵管(E1〜E3、1〜8細胞)17,18または子宮(E5-E10、8細胞-胚盤胞)19,20,21,22のいずれかから、標的の病期に応じて適切な時点でフラッシングを行う。

結果

本研究で使用した動物に関する詳細は 、表1に示す。

大腿静脈の解剖学的分析
大腿静脈の解剖学的分析は、安楽死中の2歳のオスのコモンマーモセット(I 7713M)を使用して行われました。大腿静脈と動脈は大腿骨の三角形にあります。大腿骨三角形は、腹壁と大腿筋の境界に形成されます(図1B-D

ディスカッション

静脈の位置を特定することは、採血の最も重要なステップです。解剖学的観察に基づいて、このプロトコルは、マーモセットの採血の容易な場所として大腿骨三角形の近位領域を導入します。このエリアを利用することで、大静脈からの採血が容易に行えます。しかし、このプロトコルを使用しても、動脈の損傷が発生することがあります。動脈を損傷した場合、血...

開示事項

著者は、宣言する利益相反を持っていません。

謝辞

このプロトコルの確立とマーモセットの日常的なケアにご協力いただいた沈春さん、阿久津弘子さん、阿久津弘子さん、杉木史代さん、橋本優菜さん、成富陽菜さん、坂本祐樹さん、堀米美紀子さんに感謝いたします。峯重隆之氏(原稿へのコメント)阿部由紀子さんと相葉研究室のメンバーは、接合子の収集技術を共有してくれました。CIEAは、マーモセットの飼育や40年以上にわたって培ってきた実験に関する情報を共有していただきました。本研究は、日本教育委員会、科学技術振興機構、科学研究費補助金(JP19gm6310010、JP20gm6310010、JP21gm6310010、JP22gm6310010)(AMED)、JPMJPR228B(JST)、20H05764、20H03177、22K18356(科学研究費)の助成を受けて行われました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
AIA-360Tosoh Corporation0019945Hormone measurement (P4/E2)
AIA-PACK DILUENT CONCENTRATETosoh Corporation0020956Hormone measurement (P4/E2)
AIA-PACK SUBSTRATE SET IITosoh Corporation0020968Hormone measurement (P4/E2)
AIA-PACK WASH CONCENTRATETosoh Corporation0020955Hormone measurement (P4/E2)
CMS-1CLEA JapanMarmoset food
EstrumateMSD Animal HealthPGF2alpha analog (cloprostenol)
Gonal-f Subcutaneous Injection 150Merck Biopharma Co., Ltd.FSH
Gonatropin for intramuscular injection 1000ASKA Pharmaceutical Co., Ltd.872413hCG
Heparin sodium injection solution 5,000 units/5 mLMochida Pharmaceutical Co., Ltd.224122458Blood collection
Immunochromatographic Test Kit for Detection of Common Marmoset Chorionic Gonadotropin (Dual Checker)CLEA Japan, Inc.Determining CG level
Low-profile double-arm microscope illumination LPF-SDSHIOKAZE GIKENDesk lamp for blood collection
Marmoset blood collection restraint deviceJIC JapanJM-1006Blood collection
http://www.jic-japan.jp/prd/marmoset/prd016.html
email: vi@jic-japan.jp
Metacam 0.05%Boehringer Ingelheim Animal Health Japan Co., Ltd.Hematoma treatment
Sample Cup, 3 mL, PS, for Tosoh 360 and AIA-600 II, 1000/BagGlobe Scientific110913Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK iE2Tosoh Corporation0025224Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK iE2 CALIBRATOR SETTosoh Corporation0025324Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK iE2 SAMPLE DILUTING SOLUTIONTosoh Corporation0025524Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK PROGIIITosoh Corporation0025240Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK PROGIII CALIBRATOR SETTosoh Corporation0025340Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK PROGIII SAMPLE DILUTING SOLUTIONTosoh Corporation 0025540Hormone measurement (P4/E2)
Syringe with 25 G (0.50 x 25 mm) needleTERUMOSS-01T2525Blood collection
Tensolvet 5.000 I.E. gel.Dechra Pharmaceuticals14033492Hematoma treatment
TOSOH MULTI-CONTROL SETTosoh Corporation0015965Hormone measurement (P4/E2)

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