初期ゼブラフィッシュ胚のライトシート顕微鏡イメージングとマウント戦略

要約

ライトシート顕微鏡を使用して、無傷の絨毛膜内の初期のゼブラフィッシュ胚をイメージングするためのサンプル調製戦略について説明します。これは、70%エピボリーおよび芽の段階で胚が絨毛膜内で獲得するさまざまな向きを分析し、ライトシートシステムを使用して胚全体で細胞スケールの分解能を得るためのイメージング戦略を詳しく説明します。

要約

ライトシート顕微鏡は、ゼブラフィッシュの胚を最小限の光毒性で長期間にわたってライブイメージングするための最適な方法論となっています。特に、サンプルの回転が可能なマルチビューシステムにより、胚全体をさまざまな角度からイメージングすることができます。しかし、マルチビューシステムを使用するほとんどのイメージングセッションでは、サンプルは通常ポリマーチューブ内で調製されるため、サンプルのマウントは面倒なプロセスです。このプロセスを支援するために、このプロトコルでは、70%エピボリー期と初期体節期の間の初期のゼブラフィッシュの発達をイメージングするための基本的なマウント戦略について説明します。具体的には、この研究では、絨毛膜内の70%エピボリー期と芽期における胚のデフォルト位置に関する統計を提供しています。さらに、発生の初期段階でゼブラフィッシュの胚全体をイメージングするために必要な最適な角度の数と角度の間隔について説明し、異なるビューを融合させることで細胞スケールの情報を抽出できるようにします。最後に、胚はカメラの視野全体をカバーし、これは細胞スケールの解像度を得るために必要であるため、このプロトコルでは、異なるビューの登録のために胚の上または下からのビーズ情報を使用するプロセスを詳述します。

概要

光毒性を最小限に抑えることは、生きた胚を高い時空間分解能で長期間イメージングするための主要な要件です。過去10年間で、ライトシート顕微鏡は、この要件を満たすための最適な方法論になりました1,2,3,4,5,6,7。簡単に言うと、2004年に発生過程を捉えるために初めて使用されたこの技術⁸では、整列した2枚の薄いレーザーシートが対向する端から胚を通過し、目的の平面のみを照らします。検出対物レンズを直交して配置し、サンプル中のすべての照らされた点から放出された蛍光灯を同時に収集します。次に、静的ライトシートを介して胚を順次移動させることにより、3D画像が得られます。

さらに、この方法論の特定の形態では、マルチビューライトシート顕微鏡法と呼ばれ、サンプルをローターを使用して回転させることができるポリマーチューブに懸濁することができ、複数の角度から同じ胚のイメージングを可能にする9^、10、11。イメージング後、複数の角度からの画像は、レジストレーションマーカー(通常は胚内(核など)またはチューブ内(蛍光ビーズなど)の球状蛍光マーカー)に基づいて融合されます。マルチビューイメージングとフュージョンにより、軸方向の解像度が大幅に向上し、3次元すべてで等方性分解能が得られます¹²。これは大きな利点ですが、マルチビュー法の大きな課題は、イメージングの全時間を通じて胚をチューブ内にマウントし、所定の位置に保持する必要があるサンプルマウントです。

マルチビューイメージングを行うために、胚を所定の位置に保持し、イメージング中の動きを防ぐために、胚をアガロースに埋め込むことができます。しかし、これはしばしば有害な成長と発達につながり、特にここで議論されているモデルシステムである初期段階のゼブラフィッシュ胚¹³にとっては有害です。第2の取り付け戦略は、胚の直径よりわずかに大きいだけの細いチューブを使用することであり、そこでは、胚を胚培地と共にチューブ内に引き込むことができ、続いて、チューブの底部をアガロースプラグ¹⁴で閉じることができる。この方法では、チューブが胚培地で満たされているため、蛍光ビーズなどのレジストレーションマーカーを異なるビューの融合に使用できず、したがってレジストレーションは胚内のマーカーに依存します。一般に、ビーズは、顕微鏡の照明と検出の両方の制限により、胚内のマーカーの信号がサンプルの奥深くに移動すると劣化するため、より優れたレジストレーションマーカーとして機能します。

したがって、ここで詳しく説明し、以前に^{5,13,14,15,16}使用した3番目のアプローチは、初期のゼブラフィッシュの胚を無傷の絨毛膜でイメージングし、レジストレーションマーカーとしてビーズを含む最小限の割合のアガロースをチューブに充填することです。このシナリオでは、絨毛膜内に胚を配置するための手動介入が不可能であるため、この研究では、初期のゼブラフィッシュの胚が陥るデフォルトの向きに関する統計を提供し、特に 70% のエピボリーと芽の段階に焦点を当てています。次に、細胞スケールの解像度で初期段階の胚をイメージングするために必要な最適なビュー数について説明し、FIJIベースのプラグインであるBigStitcherを使用した融合のプロセスを詳しく説明します10,17,18。20x/1 NA対物レンズを使用するこのプロトコルは、ゼブラフィッシュの発生学者が原腸陥入から早期体節期までの核および膜マーカーを持つ胚をイメージングするためのマルチビューライトシートシステムの使用を容易にすることを目的としています。

プロトコル

この研究で使用されたゼブラフィッシュの飼育および実験手順は、TIFR/IAEC/2023-1およびTIFR/IAEC/2023-5を参照し、施設の動物倫理委員会によって承認されました。 Tg(actb2:GFP-Hsa.UTRN)¹⁹を発現するヘテロ接合魚類を交配して得られた胚に、H2A-mCherry mRNA(30 pg)を1細胞期に注入した。H2A-mCherry mRNAは、pCS2+ H2A-mCherryプラスミド(オーツ研究所、EPFLからの寄贈品)を用いて in vitro 転写により合成しました。プロトコルの残りの部分で、それぞれUtr-GFPおよびH2A-mCherryと呼ばれる両方のマーカーを発現する胚を、70%エピボリーおよびバドステージでイメージングしました。本試験で使用した試薬および機器の詳細は、 資料表に記載されています。

1. マルチビューイメージング用のサンプル調製

1. FEP/PTFEチューブの調製
   1. 前述の手順に従ってFEP / PTFEチューブを清掃します¹⁴.
   2. 洗浄後、必要に応じてチューブを2〜2.5cmの長さに切断し、二重蒸留水を含む2mLの微量遠心チューブに保管します。チューブは、この方法で約1ヶ月間保存することができます。
   3. サンプル調製の前に、チューブを70〜75°Cで約25分間加熱して、チューブをまっすぐにします。各微量遠心チューブの過密を避けて凝集を防ぎ、効果的なチューブの矯正のための十分なスペースを確保します。
      注意: チューブに残った指紋/ほこりの粒子がイメージングを妨げる可能性があるため、チューブの取り扱い手順全体を通して手袋を着用してください。
2. アガロースの調製
   1. E3バッファー50xストック溶液を次のように調製します。
      1. ストック 1 - 3.252 g の Na₂HPO₄、0.285 g の KH₂PO₄、11.933 g の NaCl、0.477 g の KCl を 1 L の脱イオン水に溶かします。
      2. ストック2 - 2.426 gのCaCl₂、4.067 gのMgSO₄、1 Lの脱イオン水。
   2. 1x E3バッファーを作製するには、ストック1と2の溶液をそれぞれ20 mLずつ960 mLの脱イオン水に加えます。
      注:イメージングに使用するE3バッファーにメチレンブルーを添加すると、光の散乱を引き起こすため、添加しないでください。
   3. 低融点アガロースを1x E3に溶解し、ヒートブロック上で70〜75°Cで加熱し、溶液が塊や結晶なしで透明になるまで攪拌します。
   4. マルチビューイメージングを行うには、市販の蛍光ビーズ( 材料表を参照)をアガロース溶液に添加すると、解析中の画像レジストレーションが可能になります。ビーズを40kHzの周波数で室温で20〜30分間、水浴超音波装置で超音波処理し、ビーズを解凝集します。
   5. 超音波処理後、15mLチューブ内の10mLのアガロース溶液に1μLのビーズを加え、チューブをしっかりとボルテックスしてビーズが均一に分散するようにします。
      注:アガロースに添加するビーズ溶液の量は、原液とメーカーによって異なります。さまざまな容量を試し、ライトシートシステムでイメージングしたときにビーズが十分に分散しているように見える濃度を選択してください。超音波処理やボルテックスにもかかわらず、ビーズが多すぎると凝集する可能性がありますが、ビーズが少なすぎると画像のレジストレーションに影響を与える可能性があります。
   6. ビーズを添加したアガロースチューブを、サンプル調製前に少なくとも30分間37°Cに維持した密閉水浴に保管してください。これにより、アガロースの温度が70°Cから37°Cに下がります。
3. サンプル調製
   1. イメージングの日の前夜に仕切り付きのペアで魚をセットアップします。仕切りを約15分間取り外し、標準的な手順²⁰を使用して胚を採取します。
   2. 胚がサンプル調製の対象となる段階に達したら、37°Cに保たれた10 mLのアガロース(ビーズ付き)全体を6 cmのシャーレに注ぎます。
   3. 約2〜3分待って温度を33°C未満にしてから、10〜15個の胚をアガロース溶液に移します。
      注:これは、アガロースに移植された胚への熱ショックを防ぐための重要なステップです。
   4. 胚移植時にアガロース溶液に添加するE3バッファーをできるだけ少なくしてください。ペトリ皿を渦巻かせて、転送されたであろう小さなバッファーが十分に分散されるようにします。
   5. サンプル調製手順の残りの部分では手袋を着用してください。
   6. 適切なピペットチップが付いた200μLのマイクロピペットを取り、 図1A、Bに示すように、マイクロ遠心チューブから取り出した洗浄済みのストレートチューブをピペットチップに挿入します。
   7. 少量のアガロースをチューブに吸引し、続いてマイクロピペットを使用して2〜3個の胚を吸引します(図1C、D)。胚がチューブの底に近づいていることを確認してください(図1E)これは、イメージングを設定する際に重要になります。また、異なる胚の間に小さなアガロースがあることを確認して(図1E)、この領域のビーズをレジストレーションマーカーとして使用できるようにします。
   8. ピペットからの圧力を解放せずに、チューブをピペットチップから取り外し、E3で満たされたシャーレの蓋に置いて、アガロースを固めます(図1F)。
   9. ペトリ皿内のすべての胚がチューブに移されるまで、手順1.3.6から1.3.8を繰り返します。
   10. アガロースが固まったら(これには5〜10分かかり、ペトリ皿内のアガロースを確認することで確認できます)、チューブをE2で満たされた3mL微量遠心チューブに移します(図1G)。
   11. マルチビューイメージングに進む前に、必要に応じて、胚の入ったチューブを28°Cまたは33°Cのインキュベーターに保管してください。

2. マルチビューイメージング

注:このステップでは、ゼブラフィッシュの胚の初期発生段階におけるマルチビューイメージングの一般的な手順を示します。以下に詳述する方法は、あらゆるマルチビューライトシート顕微鏡システムに簡単に適応させることができます。

1. 胚の位置を特定する
   注:顕微鏡のサンプルチャンバーに胚培地²⁰を満たし、イメージングの少なくとも10分前にサンプルチャンバーの温度を目的の温度に設定する。
   1. ただし、サンプルホルダーは、前述^した21のように、1つの変更を加えて組み立てます。イメージングはチューブを介して行われるため、胚が入ったチューブを適切な直径の毛細血管に直接挿入し、アガロースを押し出して底部の胚を乱さないように所定の位置に保持します(図1H)。
      注:サンプルチャンバーには高さが定義されているため、サンプル調製中に胚がチューブの底に向かって配置されていることを確認すると(ステップ1.3.7で述べたように)、チャンバーの床にぶつかることなく胚を視野に配置することができます。
   2. サンプルホルダーをマルチビューシステムに挿入し、XコントロールとYコントロールを使用して胚を視野の中心に近づけます。
   3. 標本ナビゲーターのzコントロールを使用して、胚に焦点を合わせます。
   4. この時点で、絨毛膜内の胚の向きがはっきりと見えるようになり、満足できない場合は、新しいチューブを挿入して、関心のある向きの胚を選択します。
2. ライトシートの位置合わせ
   1. 胚が所定の位置に配置されたら、レーザー、光路、フィルター、ビームスプリッター、カメラなど、すべての実験設定を設定します。
   2. 取得パラメータの設定中に、ソフトウェアに ピボットスキャンのオプションがある場合は、それを選択します。ピボットスキャンは、サンプル内の構造や不透明な領域に遭遇したときにライトシートから現れるシャドウイング効果を軽減します。
   3. サンプルのライブスキャンを開始します。ビットサイズ、レーザー出力、および目的のズームを設定することで、ライトシートの厚さ、つまり軸方向の解像度が決まります。
   4. ライトシートを揃えるには、まず 片面照明 に切り替えて、 2枚のライトシート (左右)の設定を順番に変更してください。サンプルの領域にデジタルでズームインし、目的の明確な構造が見えます。
      注:この研究では、核マーカー(H2A-mCherry)または膜マーカー(Utr-GFP)のいずれかを使用してシートを整列させました。ソフトウェアでライトシートの設定を変更すると、関心領域で信号のコントラストが最もシャープになります。
   5. 2つのライトシートが個別に最適化され、最適な信号が得られたら、両方のライトシートをオンにします。2回目のアライメントを行い、ちらつきが最小限に抑えられていること、つまり2枚のシートがかなり良好にアライメントされていることを確認します。
   6. 位置合わせが完了したら、ソフトウェアで許可されている場合は、2つのシートによって生成された画像を自動的に融合するオプションを有効にします。あるいは、最初にサンプルの周りのビーズに焦点を合わせてライトシートを粗く整列させ、次にサンプルからの情報を使用して整列を微調整することもできます。
      注:2つの蛍光色素(核マーカーや膜マーカーなど)でイメージングする場合、通常、最適なアライメントは2つの構造でわずかに異なります。このシナリオでは、ダウンストリーム処理の制約に基づいて設定を選択します。たとえば、細胞の境界をセグメント化する場合、これは比較的処理負荷がかかりますが、メンブレンマーカーに基づいてライトシートを整列させます。
3. マルチビューイメージングの設定
   1. ライトシートを整列させた後、zスタックとマルチビューイメージングを実行するオプションをアクティブにします。
   2. ライブスキャンを開始し、標本ナビゲーターを使用してナビゲートし、最初のビューを選択します。このビューでは、スライス間隔を設定し、その後に z スタックの最初と最後のスライスを設定します。この位置をマルチビューダイアログボックスに追加すると、このビューの位置とZスタック情報が記録されます。
   3. 試料ナビゲーターで角度を変更して、次のビューに移動します。2 番目のビューの Z スタックを設定し、マルチビュー ダイアログ ボックスに情報を追加します。
   4. 追加のビューについても同じことを繰り返します。
      注: 各ビューで特定の最小数のスライスがイメージ化されるようにして、異なるビュー間に十分なオーバーラップを確保し、最終的に処理中にビューを登録するのに役立ちます。スライスの最小数は、ズーム係数とイメージング用に選択した角度の数によって異なります。
   5. すべてのビューを設定した後、この情報をテキストファイル(たとえば、「embryo-positions」という名前)に保存します。これには、zスタック情報、チューブの(x、y、z)座標、および各ビューの角度の仕様が含まれます。保存後、マルチビューダイアログボックスからすべての位置をクリアします。
   6. イメージングは比較的大きい無傷の絨毛膜で行われるため、同じ設定でチューブ内のビーズを見ることはできません。そのため、ビーズ情報はチューブ内の異なる位置から取得する必要があります。これを行うには、ビーズが見える胚から離れた別の「y」座標に変換します。この位置をマルチビューダイアログボックスに追加し、この位置をテキストファイル(たとえば、「beads-y」という名前)に保存します。
      注:2つの位置でのチューブの曲率の違いによる影響を最小限に抑えるために、ビーズをできるだけ胚サンプルの近くに画像化します。したがって、チューブ内に複数の胚がマウントされている場合は、ビーズを画像化するためにチューブの間に小さなアガロースを残すことが重要です(ステップ1.3.7で述べたように)。
   7. テキストファイルが保存されているフォルダに移動し、「embryo-positions」ファイルを「beads-positions」という名前の新しいファイルに複製します。'beads-positions' ファイル内のすべてのビューの y 座標を 'beads-y' ファイルの y 座標で置き換えます。これにより、ビーズは同じビュー数、zスタック、x座標で、チューブ内の異なるy位置で画像化されます。
   8. イメージングソフトウェアに戻り、ソフトウェアに「bead-positions」ファイルをロードします。時系列オプションがアクティブになっている場合は、1 つのサイクルを選択して実験を開始します。ビーズ画像を「ビーズ」として保存し、画像処理中にさまざまなビューを登録するために使用されます。
   9. ビーズ画像を撮影した後、位置をクリアし、ソフトウェアに最初の「胚位置」ファイルをロードします。適切な時間間隔で必要なサイクル数を設定し、実験を開始します。

3. マルチビュー画像解析

注:マルチビュー画像を融合するために、Multiview Reconstructionプラグインの最新バージョンであるFIJIプラグインであるBigStitcherが利用されます10,17,18。このプラグインをインストールするには、「ヘルプ」メニューの「更新」オプションでアクセスできる「更新サイトの管理」機能にBigStitcherプラグインを追加します。インストールが完了すると、プラグインは「プラグイン」メニューの下に表示されます。融合に関与する広範なステップは次のとおりです:(1)ビーズと胚の両方について.xml/.h5ファイルペアを定義します。(2)すべてのビューをビーズファイルに登録します。(3)デコンボリューションに使用できるビーズの抽出点像分布関数(PSF)(図2A)。(4)登録情報とPSF情報をビーズファイルから胚ファイルに移し、マルチビューデコンボリューションを開始します。これらのステップの大部分は、詳細²¹で以前に説明されており、ここでは、異なる方法で処理されるステップが説明されている。

1. .xmlデータセットの定義
   1. ビーズと胚の両方について、新しいデータセットをそれぞれ「beads.xml」と「embryo.xml」として定義する(^前述の21)。
2. インタレストポイントを使用した検出と登録
   1. beads.xmlファイルが正常にエクスポートされたら、[Multiview Explorer]ダイアログボックスで登録に必要なビューを選択します(図2B)。右クリックして [Detect Interest Points] を選択します。²¹ で説明されている手順に進みます。
   2. 関心ポイントを検出したら、すべてのビューを選択して右クリックし、[ Register using Interest Points] を選択します。²¹で説明されているプロトコルに従います。
   3. ビードの登録が正常に機能したかどうかを慎重に確認してください。レジストレーションが成功すると、異なるビューからの重なり合うビーズが重ね合わせられます(図2C)。レジストレーションがどの程度正確に機能したかを確認するには、2つの連続するビューを選択し、重なり合う領域に移動し、2つのビューを切り替えて、異なる角度から画像化されたビードが重ね合わされているかどうかを確認します。これを連続するビューごとに繰り返します。
   4. オーバーラップが正確でない場合は、登録に必要な意味やオーバーラップの許容誤差 ([登録] ダイアログ ボックスでは "RANSAC エラー" と呼ばれます) を緩和して登録を再試行します。
   5. 登録が成功したら、「Multiview Explorer」ウィンドウで 「保存 」をクリックして、更新された.xmlファイルを保存します。
      注: 登録の効率に関する詳細な情報が含まれているため、ログ ファイルも保存してください。ビーズから胚への登録情報を翻訳するには、以下の手順に従います。
   6. 選択したテキストエディタで bead.xml ファイルを開き、[ViewRegistrations]の下のブロック全体をコピーします。
   7. embryo.xmlを開き、「ViewRegistrations」ブロックをビーズファイルからコピーしたブロックに置き換えます。複数のチャンネルがある場合は、上記のように各チャンネルの登録情報を置き換えてください。登録情報は、手動で転送することも、ここからダウンロードできるカスタム記述の MATLAB コードを使用して転送することもできます https://github.com/sundar07/Multiview_analysis
   8. 「BigStitcher」で embryo.xml ファイルを開き、胚の登録が正常に機能したかどうかを注意深く確認してください。ビーズに対して行ったのと同じことを繰り返し、連続する2つのビューごとに対象の構造の重なりを確認します。
      注:時折、ビーズが完全に登録されているにもかかわらず、胚の登録がそれほど望ましくない場合があります。これは、ビーズが画像化された位置から胚の位置までチューブの湾曲にわずかな変化がある場合に可能です。さらに、胚は絨毛膜内を自由に浮遊しているため、視線間で微妙な動きがある可能性があります。この場合、胚の核マーカーを使用して2回目の登録を行います。
   9. これを行うには、「BigStitcher」で embryo.xml ファイルを開き、核マーカーを含むすべてのビューを右クリックして、[ インタレストポイントの検出]を選択します。
   10. 関心点の名前を「nuclei」に変更し、ビーズに対して実行した手順に進みます。
   11. 「ガウスの差」パラメータを設定するときは、すべてではないにしてもほとんどの原子核が検出され、異所性核が検出されないことを確認してください。次に、[ 完了]をクリックします。
   12. これに続いて、これらのビューを登録するには、 Register using Interest points を選択し、 Precise descriptor based (translation-invariant) オプションを選択します。[すべてのビューと関心ポイントを比較] オプションが選択されていることを確認し、関心ポイントとして 'nuclei' を使用します。最初のビューを固定するオプションを使用し、マップし直さないでください。
   13. 登録には、厳密な正則化とプラグインの既定のパラメーターを持つアフィン モデルを使用します。
   14. 2つの連続したビューごとに比較して、登録の成功を再確認します。
   15. 登録が成功したら、「Multiview Explorer」ウィンドウで 「保存 」をクリックして、更新された.xmlファイルを保存します。
   16. 選択したテキストエディタでembryo.xmlファイルを開き、核マーカーから他のチャンネルに登録情報をコピーします。
3. 点像分布関数の抽出と割り当て
   1. マルチビューデコンボリューションを実行するには、登録したビーズデータセットからイメージングシステムのPSFを抽出し、それを胚ファイルに適用します。
   2. この情報を取得するには、ビード ファイル内のすべてのビューを選択し、右クリックして[ ポイント スプレッド関数 ]と [抽出 ]オプションを選択します。
   3. 表示されるダイアログボックスで、[ 対応するインタレストポイントを使用 ]と[ PSFから最小強度投影を削除 ]がオンになっていることを確認し、デフォルトのPSFサイズで続行し、[ OK]をクリックします。
      注: すべてのビューで PSF の抽出が成功した場合、ログ ファイルには「抽出された n/n 個の PSF」と表示されます
   4. その後、.xmlファイルを再保存します。「Multiview Explorer」ダイアログボックスのPSF列にチェックマークが付けられたチェックボックスが表示され、抽出されたすべてのPSFとともにそれぞれのフォルダに「psf」フォルダが生成されます。
   5. embryo.xml ファイルを開き、各ビューに PSF を個別に割り当てます。「ビュー」を右クリックして→「Point Spread Functions」をクリックし→「Assign」を選択し、「Advanced」を選択してから、「選択したすべてのビューに新しいPSF→割り当てる」を選択します。[参照]をクリックし、.xmlファイルパスに移動して、psfフォルダを開きます。
   6. 選択したビューで対応するIDと一致するPSFを選択し、[ OK]をクリックすると、[マルチビューエクスプローラー]ウィンドウにPSFチェックボックスがチェックされて表示されます。
   7. 他のすべてのビューに対してこのプロセスを繰り返します。
4. マルチビューフュージョンとデコンボリューション
   1. ポイント スプレッド関数をすべてのビューに割り当てたら、右クリックして[ マルチビュー デコンボリューション]を選択します。
   2. 現在選択されているビューとして 境界ボックス を選択します。この作業では、デフォルトのOSEMアクセラレーションと反復回数が適切に機能します。
   3. より高速な計算が必要な場合、または CPU メモリが制限されている場合は、必要に応じて画像をダウンサンプリングします。
      注意: 必要なRAMが既存のメモリを超えると、ウィンドウの下部に赤色の警告エラーメッセージがポップアップ表示されます。この警告が表示された場合は、処理中のある時点でプラグインが停止して応答を停止するため、デコンボリューションを開始しないでください。
   4. デコンボリューションの進行状況を評価するには、5 回の反復ごとに結果が表示されるログ ファイルを確認します。
   5. 計算速度を上げるには、GPU でマルチビューデコンボリューションを実行します (以前にインストールされている場合)。
      注:このプロセスの最後に、融合した画像ウィンドウがポップアップ表示され、tiffファイルとして保存できます。

結果

サンプルを正確に方向付けることは、顕微鏡セットアップを効率的に使用するために不可欠な部分です。ただし、マルチビューライトシートシステムを使用する場合、チューブ内でサンプルを調製する必要があるため、サンプルを手動で方向付けすることは不可能な場合がよくあります。そこで、絨毛膜内で胚が占めるステレオタイプな位置があるかどうかを調べる...

ディスカッション

関心領域を画像化するために胚を正しい向きに配置することは、ユーザーの顕微鏡セッションが失敗することが多い律速ステップの1つです。これは、サンプルがチューブ内に埋め込まれているため、向きを手動で操作することが難しいマルチビューライトシート顕微鏡ではなおさらです。このプロセスを支援するために、この研究では、胚の入ったポリマーチュー?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	A9414
Calcium Chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	12022
FIJI			Version: ImageJ 1.54f
Latex beads, carboxylate-modified polystyrene, fluorescent red, 0.5 μm mean particle size, aqueous suspension	Sigma-Aldrich	L3280
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	M2773
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription kit	ThermoFischer Scientific	AM1340	For in vitro transccription of H2A-mCherry plasmid
Potassium Chhloride	Sigma-Aldrich	P9541
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662
PTFE Sleeving AWG 15L - 1.58 mm ID x 0.15 mm Wall +/-0.05	Adtech Innovations in Fluoroplastics	STW15	PTFE tubes
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S3014
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	71640
Ultrasonic Cleaner	Labman	LMUC3	Ultrasonicator
Zeiss LightSheet 7 System	Zeiss