疾患進行を模倣し薬物活性を予測する非小細胞肺癌の同所性異種移植モデルの構築

要約

この研究は、蛍光A549-iRFP細胞の多細胞スフェロイドの肺内接種に基づく同所性非小細胞肺がん(NSCLC)モデルを示しています。このモデルは、長波長蛍光の動的 in vivo モニタリングに従って、臨床NSCLC病期を再現し、シスプラチンに応答します。

要約

非小細胞肺がん(NSCLC)は、複雑で不均一な腫瘍微小環境を伴う致死性の高い疾患です。現在、がん細胞懸濁液の皮下接種に基づく一般的な動物モデルは、NSCLCの腫瘍微小環境を再現していません。ここでは、三次元多細胞スフェロイド(MCS)の肺内接種を採用したマウスの同所性肺がん異種移植モデルについて説明します。具体的には、蛍光ヒトNSCLC細胞(A549-iRFP)を低付着96ウェルマイクロプレートでコラーゲンと共に3週間培養してMCSを形成し、これを胸腺ヌードマウスの左肺に肋間接種して同所性肺がんモデルを確立しました。

A549-iRFP細胞株のMCSは、元のA549細胞株と比較して、抗がん剤に対して同様の反応を示しました。A549-iRFP細胞の長波長蛍光シグナルは、スフェロイド体積、細胞生存率、細胞タンパク質レベルなど、がん細胞増殖の一般的なマーカーと強く相関していたため、蛍光イメージングによる in vivo でのがん増殖の動的モニタリングが可能になりました。マウスへの接種後、A549-iRFP MCS異種移植片は、原発腫瘍の拡大、隣接する二次腫瘍の出現、対側右肺および遠隔臓器へのがん細胞の転移など、NSCLCの臨床病期によく似た段階を経て確実に進行しました。さらに、このモデルは、ベンチマークとなる抗肺がん治療薬であるシスプラチンに反応し、予想される毒性とがんの進行が遅いことが示されました。したがって、このNSCLCのマウス同所性異種移植モデルは、疾患の進行を再現し、潜在的な抗がん剤の開発を促進するためのプラットフォームとして機能します。

概要

すべての腫瘍性疾患の中で、肺がんは最も多くの生命損失をもたらすだけでなく、米国で毎年2番目に多い新規患者数を主張しています¹。この壊滅的な悪性腫瘍は、現代医療における大きな障害となっており、その複雑な生物学とより効果的な治療法のより深い理解が求められています²。非小細胞肺がん(NSCLC)は肺がんの85%を占め、固形腫瘍に発展する傾向があります³。肺がんにおける最も重要な課題の1つは、動的で不均一な腫瘍微小環境であり、これはがんの進行と治療介入に対する反応に深く影響します^4,5,6。NSCLCのさまざまな段階におけるがん細胞とその微小環境との相互作用をより深く理解するには、NSCLC進行の組織学的特徴を再現する洗練された病理学的モデルが必要です。

この点で、同所性動物モデルは、NSCLC研究の有望な手段として浮上しています。一般的に採用されている皮下異種移植モデル⁷とは異なり、同所性モデルは、起源の臓器に直接接種されるがん細胞を特徴としています。肺がんの場合、これはがん細胞を直接肺組織に移植することを意....

プロトコル

動物実験は、太平洋大学の動物管理・使用委員会(IACUC)の承認を得て実施されました(動物プロトコル19R10および22R10)。本研究では、体重 5 〜 6 週齢、体重 20 〜 25 g の 8 匹の雄の胸腺ヌード マウスを、参照されたげっ歯類の餌で飼育し、病原体を含まない (SPF) 条件下で飼育しました。ケージ、寝具、飲料水はオートクレーブ滅菌され、定期的に交換されました。マウスでの腫瘍接種の概略図を 図1に示します。このプロトコルで使用されるすべての材料と機器に関連する詳細については、 材料の表 を参照してください。

1. A549-iRFP細胞の3次元MCSの確立

1. A549-iRFP細胞(ヒト肺腺がん)を5% CO₂ 、37°Cの加湿雰囲気でインキュベートし、10%ウシ胎児血清、1%ペニシリン-ストレプトマイシン、および1 μg/mLピューロマイシンを含む完全増殖培地DMEMで増殖させます。
2. 0.3% コラーゲンを添加した 100 μL の完全増殖培地を使用して、A549-iRFP 細胞を 96 ウェル超低接着の丸底スフェロイドマイクロプレートに播種し、播種密度 4,000 細胞/ウェルで行います。
3. マイクロプレートを300 × g で4°....

ディスカッション

A549-iRFP MCSの構築は、簡単で再現性の高いラボ手順であり、複数の細胞株のMCS形成に変換することができます。遠心分離とコラーゲンの助けを借りて生成されたMCSは、3〜4日以内により一体的で固形腫瘍のような構造を示します。この方法により、堅牢なスフェロイドが形成され、その一体構造を長期間、通常は2〜3週間、または小さな出芽が出現し始めるまでさらに長く維持できます。遠心?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 µL Glass Syringe	Hamilton	Part/REF #80601
20 G Needle	Thermo Fisher Scientific Inc.	14 826D
96-well Ultra-Low-Attachment Spheroid Microplate	Corning	15-100-173
A549-iRFP	Imanis Life Sciences	CL082-STAN
AIN-93M Mature Rodent Diet	Research Diets, Inc.	D10012M
Athymic Nude Mouse	Charles River Laboratories, Inc.	Strain Code: 490; homozygous
BCA	Pierce	23227
Buprenorphine Hydrochloride	Patterson Veterinary	NDC Number: 42023-179-05
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay	Promega	G9683
Collagen	Gibco	A1064401
DMEM	Corning	MT10013CV
Fetal Bovine Serum (FBS)	Cytiva HyClone	SH3039603
ImageJ	Open source tool (https://imagej.net/ij/)	N/A
Image Studio	LI-COR	Version 5.2
Isoflurane	Patterson Veterinary	NDC Number: 17033-0091-25
Ketamine	Patterson Veterinary	NDC Number: 50989-0161-06
Microscope	Keyence	Model number: BZ-X710
Matrigel	Corning	CB-40234
Odyssey Infrared Imaging 205 System	LI-COR	Model number: 9140
PBS	Corning	MT21040CV
Pearl Trilogy small animal imaging system	LI-COR	Model number: 9430
Penicillin-Streptomycin	Corning	MT30002CI
Puromycin	Thermo Fisher Scientific Inc.	AAJ67236XF
ReViSP software from MATLAB	Open source tool on Sourceforge (https://sourceforge.net/projects/revisp/)	N/A
Surgical Clips--AutoClip System	Fine Science Tools	12020-00
Xylazine	Patterson Veterinary	NDC Number: 61133-6017-01