PMA分化型THP-1マクロファージのLPSおよびATP誘発死とその検証

要約

このプロトコルは、PMA 分化型 THP-1 マクロファージの LPS および ATP 誘発死に基づいています。フローサイトメトリーを用いてアネキシンVと7-AADの二重染色を解析し、細胞死を検出し、細胞全体を用いて走査型電子顕微鏡を用いて細胞膜の形態を観察しています。

要約

細胞死は、すべての生物の基本的なプロセスです。このプロトコルは、リポ多糖類(LPS)およびアデノシン三リン酸(ATP)誘導ホルボール-12-ミリスチン酸-13-アセテート(PMA)-分化脂質沈着をヒト単球(THP-1)マクロファージモデルに確立し、細胞死を観察します。LPSとATPの組み合わせは、ピロトーシスの研究によく使用される古典的な炎症誘発法ですが、アポトーシスとネクロプトーシスもLPS/ATPによる刺激に反応します。通常の状況では、ホスファチジルセリンは原形質膜の内側のリーフレットにのみ局在しています。しかし、ピロトーシス、アポトーシス、ネクロプトーシスの初期段階では、細胞膜は無傷のままホスファチジルセリンにさらされ、後期には細胞膜の完全性が失われます。ここでは、フローサイトメトリーを用いてアネキシンVと7-アミノアクチノマイシンD(AAD)の二重染色を解析し、全細胞からの細胞死を検出しました。その結果、LPS/ATPによる刺激後にかなりの細胞が死滅したことが示されています。走査型電子顕微鏡を用いて、個々の細胞における細胞死の可能な形態を観察します。その結果、LPS/ATPによる刺激後に細胞がピロトーシス、アポトーシス、またはネクロプトーシスを起こす可能性があることが示されています。このプロトコルは、LPS/ATPによる刺激後のマクロファージの死を観察することに焦点を当てています。その結果、LPSおよびATP刺激後の細胞死はピロトーシスに限らず、アポトーシスおよび壊死性アポトーシスも起こり得ることが示され、研究者がLPSおよびATP刺激後の細胞死をよりよく理解し、より優れた実験方法を選択するのに役立ちます。

概要

細胞死は、すべての生物における基本的な生理学的プロセスです。近年、細胞死が生体内の免疫とバランスに関与していることが、実質的な研究で示されています。細胞死を研究することは、病気の発症と発症をよりよく理解するのに役立ちます。プログラム細胞死のいくつかの形態が説明されており、これらのプロセスにおけるいくつかの主要な標的が特定されています。ピロトーシス、アポトーシス、およびネクロプトーシスは、内部バランスと疾患に関与する遺伝的に定義された3つのプログラム細胞死経路です¹。

ピロトーシスは、膜孔の形成および細胞内容物の放出を特徴とする。活性化されたカスパーゼまたはグランザイムは、ガスデルミンを切断してN末端ドメインを分離し、その後、オリゴマー化してメンブレンに結合し、細孔^{を形成します2,3,4}。ガスデルミン孔は、細胞膜を横切る非定型の分泌チャネルを提供し、その結果、内容物の放出やイオン流入などの下流の細胞応答が引き起こされます^2,3,4。最終的に、細胞は最終的に、ニン....

プロトコル

1. 細胞株と細胞培養

1. 10%ウシ胎児血清、1%ペニシリン-ストレプトマイシン、および0.05 mM β-メルカプトエタノールを含むRPMI-1完全培養培地で、ヒト単球細胞株THP-1を増殖させます。細胞を37°Cで5%_CO2 加湿空気中で培養します。2〜3日ごとに細胞を継代培養します。
   注:THP-1は懸濁細胞であり、培地の半分を継代培養用に交換することを選択します。光学顕微鏡で多くの細胞片を観察する場合は、300 x g で室温で3分間遠心分離します。予め温めた新鮮な完全細胞培養培地に細胞を再懸濁します。
2. すべての実験で、細胞(継代4〜10)を対数成長段階で使用します。細胞が良好な状態にあり、対数成長段階にあるとき、細胞は丸く、明るく、密度が高く、100 xの光学顕微鏡下で凝集物や細胞片がありません。

2. THP-1細胞の分化

1. 1mMの濃度のPMAのストック溶液を調製します(1mgのPMAを1.62mLのジメチルスルホキシドに溶解します)。PMAストック溶液を完全細胞培養培地で希釈し、最終使用濃度100 nMにします。
2. 培養皿内の細胞を10 mLの滅菌遠心チューブに集めます。300 x g で室温で3分間遠心分離し、PMAを含む3 mLの完全培地で細....

ディスカッション

この原稿では、PMA分化型THP-1マクロファージのLPSとATP誘発死を検出するために2つの方法を使用しました。アネキシンV/7-AAD二重染色を使用し、その結果をフローサイトメトリーで全染色から解析しました。他のフローサイトメトリー解析と同様に、未染色細胞のグループと単一染色細胞の2つのグループを、偽陽性と偽陰性の結果を排除するために設定しました。その結果、LPS/ATP刺激後、いく?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% pancreatic enzyme solution (excluding EDTA)	BOSTER Biological Technology co.ltd	PYG0068
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube	CORNING	352235
5 mL centrifuge tube	Labgic Technology Co., Ltd.	BS-50-M
6-well plate	Sorfa Life Science Research Co.,Ltd	220100
Annexin V-PE/7-AAD apoptosis analysis kit	Absin (Shanghai) Biological Technology co.ltd	abs50007	Annexin V-PE, 7-AAD, 5×Binding buffer, Apoptosis Positive Control Solution
celculture CO2 incubator	Esco (Shanghai) Enterprise Development Co., Ltd.	N/A
cell culture dish, 100 mm	Sorfa Life Science Research Co.,Ltd	230301
Cellometer K2 Fluorescent Cell Counter	Nexcelom Bioscience LLC	Cellometer K2
Cellometer SD100 Counting Chambers	Nexcelom Bioscience LLC	CHT4-SD100-002
centrifuge machine	Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd	L530
chromium alum	Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.	PA04354
cover glasses, 9 mm	Labgic Technology Co., Ltd.	BS-09-RC
critical point dryer	Quorum Technologies	K850
dimethyl sulfoxide	BOSTER Biological Technology co.ltd	PYG0040
electron microscope fixative	Servicebio Technology co.ltd	G1102	2.5% glutaric dialdehyde, 100 mM phosphorous salts
electronic balance	SHIMADZU	ATX124
ethanol absolute	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd	2021033102
flow cytometer	Becton,Dickinson and Company	FACSCanto
flow cytometry analysis software	Becton,Dickinson and Company	BD FACSDivaTM Software
gelatin	Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.	PA00256
High resolution cold field emission scanning electron microscope	TITACHI	Regulus 8100
human monocytic cell line THP-1	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.	CL0233
inverted microscope	Leica Microsystems Co., Ltd	DMi1
IR Vortex Mixer	VELP Scientifica Srl	ZX4
lipopolysaccharide	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	L8880	LPS is derived from Escherichia coli 055:B5
Na2ATP	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	A8270
phorbol-12-myristate-13-acetate	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	P6741
phosphate-buffered saline	Servicebio Technology co.ltd	G4202
Pipette	Eppendorf AG	N/A
pipette tips, 10 μL	Servicebio Technology co.ltd	T-10PL
pipette tips, 1 mL	Servicebio Technology co.ltd	T-1250L
pipette tips, 200 μL	Servicebio Technology co.ltd	T-200L
RPMI-1640 complete culture media	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.	CM0233	RPMI-1640 + 10% FBS + 0.05mM β-mercaptoethanol + 1% P/S
RPMI-1640 culture media	Shanghai BasalMedia Technologies Co., LTD.	K211104
sheath fluid	BECKMAN COULTER	8546733
sputter coater	Cressington Scientific Instruments Ltd	108
thermostatic water bath	GUOHUA Electric Appliance CO.,Ltd	HH-1