PMA分化型THP-1マクロファージのLPSおよびATP誘発死とその検証

要約

このプロトコルは、PMA 分化型 THP-1 マクロファージの LPS および ATP 誘発死に基づいています。フローサイトメトリーを用いてアネキシンVと7-AADの二重染色を解析し、細胞死を検出し、細胞全体を用いて走査型電子顕微鏡を用いて細胞膜の形態を観察しています。

要約

細胞死は、すべての生物の基本的なプロセスです。このプロトコルは、リポ多糖類(LPS)およびアデノシン三リン酸(ATP)誘導ホルボール-12-ミリスチン酸-13-アセテート(PMA)-分化脂質沈着をヒト単球(THP-1)マクロファージモデルに確立し、細胞死を観察します。LPSとATPの組み合わせは、ピロトーシスの研究によく使用される古典的な炎症誘発法ですが、アポトーシスとネクロプトーシスもLPS/ATPによる刺激に反応します。通常の状況では、ホスファチジルセリンは原形質膜の内側のリーフレットにのみ局在しています。しかし、ピロトーシス、アポトーシス、ネクロプトーシスの初期段階では、細胞膜は無傷のままホスファチジルセリンにさらされ、後期には細胞膜の完全性が失われます。ここでは、フローサイトメトリーを用いてアネキシンVと7-アミノアクチノマイシンD(AAD)の二重染色を解析し、全細胞からの細胞死を検出しました。その結果、LPS/ATPによる刺激後にかなりの細胞が死滅したことが示されています。走査型電子顕微鏡を用いて、個々の細胞における細胞死の可能な形態を観察します。その結果、LPS/ATPによる刺激後に細胞がピロトーシス、アポトーシス、またはネクロプトーシスを起こす可能性があることが示されています。このプロトコルは、LPS/ATPによる刺激後のマクロファージの死を観察することに焦点を当てています。その結果、LPSおよびATP刺激後の細胞死はピロトーシスに限らず、アポトーシスおよび壊死性アポトーシスも起こり得ることが示され、研究者がLPSおよびATP刺激後の細胞死をよりよく理解し、より優れた実験方法を選択するのに役立ちます。

概要

細胞死は、すべての生物における基本的な生理学的プロセスです。近年、細胞死が生体内の免疫とバランスに関与していることが、実質的な研究で示されています。細胞死を研究することは、病気の発症と発症をよりよく理解するのに役立ちます。プログラム細胞死のいくつかの形態が説明されており、これらのプロセスにおけるいくつかの主要な標的が特定されています。ピロトーシス、アポトーシス、およびネクロプトーシスは、内部バランスと疾患に関与する遺伝的に定義された3つのプログラム細胞死経路です¹。

ピロトーシスは、膜孔の形成および細胞内容物の放出を特徴とする。活性化されたカスパーゼまたはグランザイムは、ガスデルミンを切断してN末端ドメインを分離し、その後、オリゴマー化してメンブレンに結合し、細孔^{を形成します2,3,4}。ガスデルミン孔は、細胞膜を横切る非定型の分泌チャネルを提供し、その結果、内容物の放出やイオン流入などの下流の細胞応答が引き起こされます^2,3,4。最終的に、細胞は最終的に、ニンジュリン-1⁵によって促進される原形質膜の破裂とピロトーシス溶解を経験します。アポトーシスでは、活性化されたBaxとBakがミトコンドリア外膜上にオリゴマーを形成し、シトクロムCを放出します。これは、BCL-2ファミリーのプロアポトーシスタンパク質と抗アポトーシスタンパク質、開始剤カスパーゼ(カスパーゼ-8、-9、-10)、エフェクターカスパーゼ(カスパーゼ-3、-6、-^{7)のバランス}によって制御されます^1,6,7.アポトーシスの形態学的変化には、膜ブレブ、細胞収縮、核分裂、クロマチン凝縮、およびアポトーシス体形成が含まれます^6,8。受容体相互作用するセリン/スレオニン-プロテインキナーゼ1(RIPK3)と混合系統キナーゼドメイン様(MLKL)は、ネクロプトーシスメカニズム¹の下流の2つのコアコンポーネントです。RIPK3はMLKLを動員してリン酸化し、p-MLKLはオリゴマー化し、細胞膜と会合し、膜穿孔を開始し、イオン流入を引き起こし、細胞内浸透圧を増加させ、最終的には細胞破裂を引き起こします^6,9。ガスデルミンとMLKLは、それぞれ原形質膜に結合し、ピロトーシスとネクロプトーシスを媒介し、BAX/BAKはミトコンドリアの外膜に結合してアポトーシスを媒介^{します6。}

各経路には特定のメカニズムと結果がありますが、それらは細胞膜に同様の変化をもたらします。通常の状況では、ホスファチジルセリン(PS)は原形質膜の内葉にのみ局在しています。しかし、ピロトーシス、アポトーシス、ネクロプトーシスの初期段階では、PSは原形質膜の外側に露出します。カスパーゼ-3/カスパーゼ-7はTMEM16およびXKRファミリーを活性化し、非対称の細胞膜を生じさせ、アポトーシス¹⁰中にPSを外部化します。ガスデルミンD媒介およびMLKL媒介Ca²⁺流入は、細胞膜上のリン脂質二重層の対称性の喪失およびPSの曝露をもたらす。曝露は、細胞膜の完全性が失われる前に起こる^11,12。これら3種類のプログラム細胞死の膜の同様の変化に基づいて、フローサイトメトリーを使用してアネキシンV/7-アミノアクチノマイシンD(7-AAD)の二重染色を解析し、細胞死を検出します。カルシウム依存性リン脂質結合タンパク質であるアネキシンVは、PSに対して高い親和性を有し、これは原形質膜の表面に露出したPSを検出するための高感度プローブとして機能し得る¹³。7-AADは、細胞膜全体を通過できない核酸染色剤です。これは、一般的に使用される核酸染料であるヨウ化プロピジウム(PI)に似ています。蛍光特性は似ていますが、7-AADは発光スペクトルが狭く、他の検出チャネルとの干渉が少なくなります。これらの類似性のため、ピロトーシス、アポトーシス、ネクロプトーシスを区別するだけでは不十分です。フローサイトメトリーを使用して、全細胞からの細胞死を検出しました。2つ目の方法は、走査型電子顕微鏡(SEM)を使用して細胞膜を捕捉し、個々の細胞における細胞死の可能な形態を観察するために使用されます。

我々は、ヒト単球(THP-1)マクロファージにおけるリポ多糖(LPS)およびアデノシン三リン酸(ATP)誘導ホルボール-12-ミリスチン酸-13-アセテート(PMA)分化脂質沈着モデルを確立し、細胞死を観察した。このプロトコルは、メカニズムの調査ではなく、細胞死の観察に焦点を当てています。

プロトコル

1. 細胞株と細胞培養

1. 10%ウシ胎児血清、1%ペニシリン-ストレプトマイシン、および0.05 mM β-メルカプトエタノールを含むRPMI-1完全培養培地で、ヒト単球細胞株THP-1を増殖させます。細胞を37°Cで5%_CO2 加湿空気中で培養します。2〜3日ごとに細胞を継代培養します。
   注:THP-1は懸濁細胞であり、培地の半分を継代培養用に交換することを選択します。光学顕微鏡で多くの細胞片を観察する場合は、300 x g で室温で3分間遠心分離します。予め温めた新鮮な完全細胞培養培地に細胞を再懸濁します。
2. すべての実験で、細胞(継代4〜10)を対数成長段階で使用します。細胞が良好な状態にあり、対数成長段階にあるとき、細胞は丸く、明るく、密度が高く、100 xの光学顕微鏡下で凝集物や細胞片がありません。

2. THP-1細胞の分化

1. 1mMの濃度のPMAのストック溶液を調製します(1mgのPMAを1.62mLのジメチルスルホキシドに溶解します)。PMAストック溶液を完全細胞培養培地で希釈し、最終使用濃度100 nMにします。
2. 培養皿内の細胞を10 mLの滅菌遠心チューブに集めます。300 x g で室温で3分間遠心分離し、PMAを含む3 mLの完全培地で細胞を再懸濁します。
3. セルカウンターとカウントソフトウェアを開きます。細胞懸濁液20μLをセルカウンターボードにピペットで移し、セルカウンターボードに挿入します。 プレビューB1をクリックし、機器の右下にあるノブを回し、焦点距離を調整して、ソフトウェア上で輪郭がはっきりした明るい中心のセルを作成します。 [カウント ] をクリックしてカウントを開始します。
4. 計数結果に基づいて、PMAを含む完全培地を使用して、細胞密度を1 x 10⁶ 細胞/mLに調整します。6ウェルプレートに細胞を播種し、プレートを37°Cおよび5%CO₂ で24時間インキュベートしてから、さらなる処理を開始します。

3. THP-1細胞の治療

1. LPSのストック溶液を1 mg / mLの濃度で調製します(1 mgのLPSを1 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に溶解します)。LPSストック溶液を無血清培地で希釈し、最終使用濃度1 μg/mLにします。Na₂ATPのストック溶液を500 mMの濃度で調製します(0.3026 gのATPを1 mLのPBSに溶解します)。
2. PMA含有培地をウェルから吸引し、PBS 1xで洗浄します。無血清培地をコントロール群に加え、LPSを含む無血清培地をモデル群に加えます。プレートを37°C + 5%CO₂ で6時間インキュベートしてから、さらなる処理を進めてください。
3. 6時間後、ATPストック溶液をモデルグループに加え、最終作業濃度500 nMにします。プレートを37°C + 5% CO₂ で45分間インキュベートしてから、先に進みます。

4. フローサイトメトリー解析(方法1)

1. 実験サンプルの調製
   1. ステップ2に従って、6ウェルプレートで細胞を播種し、インキュベートします。無処理の4つの対照群を確立します:1つの無染色コントロール、2つの単一染色コントロール(各染色に1つ)、および1つの二重染色コントロール。治療群を1つ設定し、ステップ3に従って治療します。
   2. 治療後、ウェルからすべての上清を吸引し、PBS 2xで洗浄します。各ウェルに0.05%トリプシン(非EDTA)500μLを添加し、インキュベーターで30秒間インキュベートします。
   3. 各ウェルに1 mLのRPMI-1640完全培地を加えて細胞の剥離を止め、細胞を5 mLチューブに集めます。300 x g で室温で3分間遠心分離します。
   4. PBS1 mLを添加して細胞を再懸濁します。細胞の入ったチューブを37°Cの水浴に3分間入れます。すべてのサンプルを300 x g で室温で3分間遠心分離します。
   5. 200 μLの5x結合バッファーを800 μLの蒸留水で1x結合バッファーに希釈します。1x結合バッファー100 μLを添加して細胞を再懸濁し、細胞を5 mLチューブに移します。
   6. 5 μL のアネキシン V-PE 溶液を 1 本のコントロールグループ細胞のチューブに 10 分間、5 μL の 7-AAD 溶液を別のコントロールグループ細胞のチューブに 5 分間加えます (シングル染色コントロールとして個別に)。各チューブを穏やかにボルテックスして染料を混合し、光から保護された室温でサンプルをインキュベートします。各チューブに400 μLのPBSを加え、静かにボルテックスしてインキュベーションを終了します。
   7. 残りのチューブに5 μLのAnnexin V-PE溶液を加え、室温で5分間インキュベートします。各チューブを穏やかにボルテックスして染料を混合し、光から保護された室温でサンプルをインキュベートします。5分後、5μLの7-AAD溶液を室温で5分間加えます。各チューブに400 μLのPBSを加え、静かにボルテックスしてインキュベーションを終了します。
   8. 5 mLポリスチレン丸底チューブの一部である35 μmナイロンメッシュを使用して細胞懸濁液をろ過します。チューブを氷の上に置き、テストを待ちます。テストする前に穏やかに混合してから、機器に挿入します。
2. フローサイトメトリー
   1. テストには、蛍光活性化セルソーティングフローサイトメーターを使用してください。フローサイトメーターのデータ解析ソフトウェアを開き、検出器とレーザーの性能を確認します。 サイトメーター をクリックし、 Fluidicsスタートアップを選択し、システムの準備が整うのを待ちます。フローチャンバーの気泡を除外するには 、Cytometer>Clean Modes>De-gas Flow cellをクリックします。
   2. Experimentをクリックし、New folder、Experiment、Specimen、Tubeの順に選択し、Edit Nameを選択します。チューブの前にある五角形の矢印は、点灯すると緑色に変わります。
   3. Cytometer FACSCelestaのアイコン(ショートカットキーアイコン)をクリックし、Parameterを選択し、次にFSC、SSC、およびPEシグナルを選択します。グローバルワークシートのアイコン(ショートカットキーアイコン)をクリックして、PEヒストグラムを確立します。この研究で使用したフローサイトメーターでは、586 nm の Annexin V に PE を使用し、X 軸にプロットします。700 nm の 7-AAD に対する PerCP-Cy5.5 と Y 軸にプロットします。
   4. まず、未染色のコントロールサンプルを装置に挿入します。 Acquisition Dashboard のアイコン(ショートカットキーアイコン)をクリックし、目的の母集団から最低10,000のイベントを取得します。FSC-AおよびSSC-Aドットプロット上のゲート(P1)を使用してデブリを除外します。流量を 中速 に調整し、 データを記録します。電圧を調整して、セル母集団をFSC/SSCヒストグラムの対角線に配置し、[ 再起動]をクリックします。流量を 中速 に調整し、 データを記録します。
   5. [Next tube]をクリックし、Annexin Vおよび7-AADのシングル染色コントロールを実行して、コンペンセーションを調整します。残りのチューブを走らせ、データを収集します。

5. SEMイメージング(方法2)

1. 実験サンプルの調製
   1. ステップ2に従って6ウェルプレートで細胞を播種およびインキュベートし、ステップ3に従って処理します。
   2. 処理後、ウェルからすべての上清を吸引し、PBSで2回洗浄します。各ウェルに0.05%トリプシン(非EDTA)500μLを添加し、インキュベーターで30秒間インキュベートします。
   3. 各ウェルに1 mLのRPMI-1640完全培地を加えて細胞の剥離を止め、細胞を5 mLチューブに集めます。300 x g で室温で3分間遠心分離します。
   4. 500 μLの電子顕微鏡固定液(2.5%グルタル酸ジアルデヒド、100 mMリン塩)で細胞を室温で2時間固定した後、4°Cで一晩固定します。
   5. クロムミョウバン溶液を調製する:100mLの超純水にゼラチン1.0gを加え、70°Cの水浴加熱を行い、均一に攪拌します。0.05gのクロムミョウバンを加え、均等に攪拌し、濾紙で濾過します。きれいなカバーガラスをクロムミョウバン溶液に37°Cで2時間浸し、後で使用するために37°Cのオーブンで乾燥させます。
      注:実験中の細胞剥離を防ぐことが目的です。
   6. 固定溶液から細胞を採取します。300 x g で室温で3分間遠心分離します。PBSを100μL加え、細胞をやさしく吹き飛ばします。細胞懸濁液をカバーガラスに落とし、5分間放置します。すべての上清を吸引し、毎回PBSで3回5分間洗います。
      注:セルの剥離を防ぐために、操作は穏やかに行う必要があります。激しく振らず、ゆっくりと動かし、壁に沿ってゆっくりと液体を加えてください。
   7. 500 μLの1%オスミン酸固定液を1時間加えます。すべての上清を吸引し、毎回PBSで3回5分間洗います。
   8. 一連のエタノール(EtOH)濃度(30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%、100%)でサンプルを連続して脱水します。EtOH溶液あたり15分間。
      注:カバーガラスは100%EtOHで数日間4°Cに保つことができますが、過度の脱水を避けるためにできるだけ早く乾燥させる必要があります。
   9. 臨界点ドライヤーのスイッチを入れ、CO₂ タンクを開き、チャンバーを10°Cに冷却します。 チャンバー圧力が0psiになったら、サンプルを濾紙ですばやく包み、チャンバーに入れます。
   10. インレットバルブを開き、CO₂ 観察窓から観察し、2本の赤い線の間の液体_CO2 レベルを上げ(上限を超えないように)、インレットバルブを閉じます。サンプルを10分間浸します。吸気バルブと排気バルブを同時に開いて、CO₂ を1分間均等化します(液体_CO2 はEtOHを置換します)。排気バルブを閉じて液体_CO2 レベルを指定の位置まで上げ、インレットバルブを閉じます。
   11. 温度を35°Cに、圧力を1250psiに設定します。温度と圧力が安定したら、100 psi / minで減圧します。チャンバー圧力がゼロになったらサンプルを取り出し、機器のスイッチを切ります。
   12. 導電性テープを使用してSEMアルミニウム試料ホルダーに試料を取り付けます。スパッタコーターを使用して、サンプルを金の層(2〜5 nm)で覆います。
2. イメージング
   1. イメージングには高分解能の冷陰極電界放出SEMを使用します。SEMの加速電圧を3kVに設定します。作動距離を10mmに設定します。倍率を1,000倍にしてパノラマを観察します。倍率を5,000倍と20,000倍に設定して、原形質膜の位置を特定し、サンプルをイメージングします。
      注:SEMを介してPMA分化THP-1マクロファージを視覚化するプロセスは、他の種類の細胞や組織と類似しており、使用する機器によって異なります。参考文献¹⁴ には、詳細なSEMプロトコルと付属のビデオが掲載されています。

結果

細胞サンプルをプロトコールに記載されているように処理し、フローサイトメトリーの検出を行いました。正常細胞は、アネキシンVおよび7-AAD(アネキシンV-/7-AAD-)では染色できません。ピロトーシス、アポトーシス、ネクロプトーシスの初期段階では、PSはアネキシンVに曝露され、結合していましたが、細胞膜はまだ無傷であり、細胞外空間から7-AADが排除されました(アネキシンV+/7-AAD-)。後?...

ディスカッション

この原稿では、PMA分化型THP-1マクロファージのLPSとATP誘発死を検出するために2つの方法を使用しました。アネキシンV/7-AAD二重染色を使用し、その結果をフローサイトメトリーで全染色から解析しました。他のフローサイトメトリー解析と同様に、未染色細胞のグループと単一染色細胞の2つのグループを、偽陽性と偽陰性の結果を排除するために設定しました。その結果、LPS/ATP刺激後、いく?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% pancreatic enzyme solution (excluding EDTA)	BOSTER Biological Technology co.ltd	PYG0068
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube	CORNING	352235
5 mL centrifuge tube	Labgic Technology Co., Ltd.	BS-50-M
6-well plate	Sorfa Life Science Research Co.,Ltd	220100
Annexin V-PE/7-AAD apoptosis analysis kit	Absin (Shanghai) Biological Technology co.ltd	abs50007	Annexin V-PE, 7-AAD, 5×Binding buffer, Apoptosis Positive Control Solution
celculture CO2 incubator	Esco (Shanghai) Enterprise Development Co., Ltd.	N/A
cell culture dish, 100 mm	Sorfa Life Science Research Co.,Ltd	230301
Cellometer K2 Fluorescent Cell Counter	Nexcelom Bioscience LLC	Cellometer K2
Cellometer SD100 Counting Chambers	Nexcelom Bioscience LLC	CHT4-SD100-002
centrifuge machine	Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd	L530
chromium alum	Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.	PA04354
cover glasses, 9 mm	Labgic Technology Co., Ltd.	BS-09-RC
critical point dryer	Quorum Technologies	K850
dimethyl sulfoxide	BOSTER Biological Technology co.ltd	PYG0040
electron microscope fixative	Servicebio Technology co.ltd	G1102	2.5% glutaric dialdehyde, 100 mM phosphorous salts
electronic balance	SHIMADZU	ATX124
ethanol absolute	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd	2021033102
flow cytometer	Becton,Dickinson and Company	FACSCanto
flow cytometry analysis software	Becton,Dickinson and Company	BD FACSDivaTM Software
gelatin	Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.	PA00256
High resolution cold field emission scanning electron microscope	TITACHI	Regulus 8100
human monocytic cell line THP-1	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.	CL0233
inverted microscope	Leica Microsystems Co., Ltd	DMi1
IR Vortex Mixer	VELP Scientifica Srl	ZX4
lipopolysaccharide	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	L8880	LPS is derived from Escherichia coli 055:B5
Na2ATP	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	A8270
phorbol-12-myristate-13-acetate	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	P6741
phosphate-buffered saline	Servicebio Technology co.ltd	G4202
Pipette	Eppendorf AG	N/A
pipette tips, 10 μL	Servicebio Technology co.ltd	T-10PL
pipette tips, 1 mL	Servicebio Technology co.ltd	T-1250L
pipette tips, 200 μL	Servicebio Technology co.ltd	T-200L
RPMI-1640 complete culture media	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.	CM0233	RPMI-1640 + 10% FBS + 0.05mM β-mercaptoethanol + 1% P/S
RPMI-1640 culture media	Shanghai BasalMedia Technologies Co., LTD.	K211104
sheath fluid	BECKMAN COULTER	8546733
sputter coater	Cressington Scientific Instruments Ltd	108
thermostatic water bath	GUOHUA Electric Appliance CO.,Ltd	HH-1