高収率で低損傷の臍帯由来間葉系幹細胞の単離

要約

この研究は、ウォートンゼリー(WJ)の完全性を維持するための独自の鈍的解剖手順を提示し、その結果、損傷を受けたWJが少なくなり、収穫された間葉系幹細胞(MSC)の量と生存率が向上します。この方法は、従来のシャープな解剖法と比較して、優れた収率と増殖能力を示します。

要約

間葉系幹細胞(MSC)は、顕著な再生特性と免疫調節特性を持つ多能性細胞の集団です。臍帯(UC)由来のウォートンゼリー(WJ)は、MSCの優れた供給源として、生物医学分野でますます関心が高まっています。しかし、供給が限られていたり、既存の手法が標準化されていないなどの課題が生じています。この記事では、臍帯から無傷のWJを解剖することによりMSC収量を向上させる新しい方法を紹介します。この方法では、鈍的解剖を使用して上皮層を除去し、WJ全体の完全性を維持し、収穫されたMSCの量と生存率を増加させます。このアプローチにより、従来のシャープな解剖法と比較して、WJの無駄が大幅に削減されます。WJ-MSCsの純度を確保し、細胞外からの影響を最小限にするため、UCを反転させた後に内部張力を利用して内皮を剥がす手技を行いました。さらに、ペトリ皿は、外植片の培養中に短時間反転して、接着と細胞の伸長を改善しました。比較分析により、提案法の優位性が示され、従来の方法よりもWJおよびWJ-MSCの収率が高く、生存率が高いことが示されました。どちらの方法でも細胞表面マーカーの形態と発現パターンが類似していることから、さまざまなアプリケーションに対するそれらの特性評価と純度が確認されています。この方法は、WJ-MSC単離に高収量で高生存率のアプローチを提供し、MSCの臨床応用に大きな可能性を示しています。

概要

1991年にウォートンゼリー(WJ)から間葉系幹細胞(MSC)が初めて単離されて以来、これらの多能性幹細胞は、その再生特性と多系統分^化能力1により、研究者から大きな注目を集めてきました。MSCは、骨髄、末梢血、歯髄、脂肪組織、胎児(ヒト中絶)、出生関連組織²など、さまざまな供給源から単離できます。臍帯(UC)は、その非侵襲性、豊富な細胞収量と分化能力、高い増殖率、分化能、および免疫^{調節特性を示す}ため、有望な貯蔵庫として浮上しています3。胎児MSCは、強力な幹細胞性と免疫特性を示すため、過去20年間に実施された臨床試験や基礎研究の主要な焦点となっています^2,4,5。UC由来のMSCは、骨髄や脂肪組織などの他のMSC源と比較して優れた治療可能性を持っています^6,7。

UCは、羊水上皮、3つの血管(2つの動脈と1つの静脈)、および^WJ3として知られるゼラチン状物質で構成されています。興味深いこ....

プロトコル

サンプルは、中国広東省の深セン龍崗区産科小児医療病院の同意した健康なドナーから入手しました。この研究のためのヒトサンプルの使用は、深セン病院の倫理委員会、北京中医薬大学(SZLDH2020LSYM-095)、および深セン龍崗区産子医療病院の医療倫理委員会(LGFYYXLLS-2020-005)によって承認されました。すべての実験は、承認されたガイドラインに従って行われました。試薬や使用した機器の詳細は、 資料表に記載されています。

1.人間の臍帯の収集

1. 無菌条件下で協力病院からヒト臍帯サンプルを採取します。
   注:35歳未満のドナー、できれば初産婦で、肝炎、性感染症、または遺伝性疾患の病歴がないものを選択してください。B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルスの入学試験結果は陰性であることが必要です。配送方法として帝王切開を選択します。
2. 長さが約10〜15cmのまっすぐで無傷のUCピースを選択します。
3. 止血鉗子で両端を閉じ、帝王切開による満期新生児の分娩直後に鉗子の間の内側の端に外科的結び目で結紮します。( 図 1 のステップ 1 に示すように収集された UC)。
   注:帝王切開の操作により、コレクションが無菌であることが保証されます。サイズ0または2-0縫合糸の外科用....

ディスカッション

MSCは、再生医療に深い影響を与えるダイナミックな研究分野です²²。そのユニークな特性により、科学的な調査の焦点となり、さまざまな病気や怪我の治療に革命を起こす可能性を秘めています⁷。WJ-MSCはMSCの別個のサブセットであり、血管間上皮と羊水上皮の間に位置するUC内のゼラチン状結合組織から得ることができる²³。MSCの臨床応用.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
APC anti-human CD44 Antibody	Biolegend	338806
24-well cell culture plates	Thermo Scientific	142475
APC anti-human CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) Antibody	Biolegend	344006
APC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody	Biolegend	400122
Autoclave	HIRAYAMA	HVE-50
Automatic Cell Counter	Countstar	FL-CD
BAMBANKER Cryopreservation Solution	Wako	302-14681
Cell Staining Buffer	Biolegend	420201
Centrifugal Machine	Eppendorf	5424R
Clean Bench	Shanghai ZhiCheng	C1112B
CO2 Incubator	Thermo Scientific	HERAcell 150i
D-PBS	Solarbio	D1040
Electro- thermostatic Blast Oven	Shanghai JingHong	DHG-9423A
FITC anti-human CD105 Antibody	Biolegend	323204
FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody	Biolegend	328108
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody	Biolegend	400110
Flow Cytometry	Beckman	CytoFLEX
hemocytometer	Superior Marienfeld	640410
Intracellular Staining Permeabilization Wash Buffer (10×)	Biolegend	421002
Inverted Biological Microscope	ZEISS	Axio Vert. A1
Liquid Nitrogen Storage Tank	Thermo Scientific	CY50935-70
Normal saline (NS)	Meilunbio	MA0083
PBS	Solarbio	P1032
PE anti-human CD11b Antibody	Biolegend	393112
PE anti-human CD19 Antibody	Biolegend	392506
PE anti-human CD34 Antibody	Biolegend	343606
PE anti-human CD45 Antibody	Biolegend	368510
PE anti-human HLA-DR Antibody	Biolegend	307606
PE Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody	Biolegend	400114
PE Mouse IgG2a, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody	Biolegend	400214
Precision Electronic Balance	Satorius	PRACTUM313-1CN
Snowflake Ice Machine	ZIEGRA	ZBE 30-10
steriled 50 mL plastic tube	Greniner	227270
Thermostatic Water Bath	Shanghai YiHeng	HWS12
Trypsin 1:250	Solarbio	T8150
UltraGRO-Advanced	Helios	HPCFDCGL50
Ultrapure and Pure Water Purification System	Milli-Q	Milli-Q Reference
Xeno-Free Human MSC Culture Medium	FUKOKU	T2011301