骨組織の空間的トランスクリプトミクスを可能にする方法

要約

ここでは、新たに得られた骨組織の脱灰と高品質なRNAの保存を可能にする方法について述べます。また、脱灰されていない骨のホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)サンプルを切片化して、新鮮な組織が利用できない、または採取できない場合に高品質の結果を得る方法も示されています。

要約

細胞と各組織内の細胞の位置との関係を理解することは、正常な発生と疾患の病理に関連する生物学的プロセスを明らかにするために重要です。空間的トランスクリプトミクスは、組織サンプル内のトランスクリプトーム全体の分析を可能にする強力な方法であり、細胞の遺伝子発現と細胞が存在する組織学的状況に関する情報を提供します。この方法は多くの軟組織に広く利用されていますが、骨などの硬組織の分析への応用は困難でした。主な課題は、切片化のために硬組織サンプルを処理しながら、高品質のRNAと組織の形態を保持できないことにあります。したがって、ここでは、新たに得られた骨組織サンプルを処理して空間的トランスクリプトミクスデータを効果的に生成する方法について説明する。この方法により、サンプルの脱灰が可能になり、RNAの分解を回避しながら、形態学的詳細が保存された組織切片が成功裏に得られます。さらに、組織バンクから採取したサンプルなど、以前に脱灰せずにパラフィン包埋したサンプルについて、詳細なガイドラインが提供されています。これらのガイドラインを使用して、骨骨肉腫の原発腫瘍および肺転移の組織バンクサンプルから生成された高品質の空間トランスクリプトミクスデータを示します。

概要

骨は、コラーゲン1型と無機塩¹の繊維を主成分とする特殊な結合組織です。その結果、骨は非常に強くて硬いと同時に、軽くて外傷に強いです。骨の大きな強度は、そのミネラル含有量に由来します。実際、ミネラル含有量の割合が増加すると、剛性は5倍に増加します²。その結果、研究者は、組織学的切片化によって骨標本の生物学を分析する際に重大な問題に直面します。

脱灰していない骨組織学は実行可能であり、調査の種類によっては必要になる場合があります(たとえば、骨の微細構造を研究するため)。ただし、特に標本が大きい場合は、非常に困難です。これらの場合、組織学的目的での組織処理には、標準的なプロトコルと技術のいくつかの修正が必要です³。一般に、一般的な組織学的評価を行うために、骨組織は固定直後に脱灰されますが、そのプロセスは、組織のサイズと利用される脱灰剤に応じて、数日から数週間かかる場合があります⁴。脱灰切片は、骨髄の検査、腫瘍の診断などによく使用されます。脱灰剤には、主に強酸(硝酸、塩酸など)、弱酸(ギ酸など)、キレート剤(エチレンジアミンテトラセト酸(EDTA)など)^の3種類があります5。強酸は骨を非常に急速に脱灰することができますが、組織に損傷を与える可能性があります。弱酸は非常に一般的で、診断手順に適しています。キレート剤は、この場合、脱灰プロセスが遅く穏やかであるため、多くの手順( in situ ハイブリダイゼーション、免疫染色など)で必要とされる高品質の形態の保持と遺伝子およびタンパク質情報の保存を可能にするため、研究用途に最も使用され、適切です。しかし、遺伝子発現解析など、トランスクリプトーム全体を保存する必要がある場合、ゆっくりとした穏やかな脱灰であっても、有害となる可能性があります。したがって、組織の形態学的解析を細胞の遺伝子発現解析と組み合わせる必要がある場合には、より優れたアプローチと方法が必要です。

近年のシングルセルRNAシーケンシング(scRNA-seq)および空間的トランスクリプトミクスの改良により、^{組織サンプルの保存}にホルマリン固定パラフィン包埋法(FFPE)を使用した場合でも、組織サンプルの遺伝子発現を研究することが可能になりました^6,7,8。この機会により、世界中の組織バンクに保存されているものなど、より多くのサンプルへのアクセスが可能になりました。scRNA-seqを使用する場合、RNAの完全性が最も重要な要件です。しかし、FFPEサンプルの空間的トランスクリプトミクスの場合、各組織切片の組織学的状況内で遺伝子発現を可視化するためには、高品質の組織切片と高品質のRNAの両方が必要です。これは軟組織では簡単に達成できますが、骨のような硬組織では同じことが言えません。実際、私たちの知る限りでは、空間トランスクリプトミクスを用いた研究は、FFPE骨サンプルに対して行われたことがありません。これは、FFPE骨組織のRNA含有量を維持しながら効果的に処理できるプロトコルがないためです。ここでは、RNAの分解を避けながら、新たに得られた骨組織サンプルを処理および脱灰する方法が最初に提供されます。次に、世界中の組織バンクで収集されたFFPEサンプルのトランスクリプトミクス分析の必要性を認識し、脱灰されていない骨のFFPEサンプルを適切に処理するためのガイドラインも提示されます。

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プロトコル

以下に説明するすべての動物手順は、ピッツバーグ大学歯科医学部の実験動物のケアと使用に関するガイドに準拠して承認されています。

1. 脱灰が必要な骨組織サンプルのFFPEブロックの作製方法

1. 試薬および材料の調製
   1. EDTA 20% pH 8.0を調製します。1Lの場合、200gのEDTAを800mLの超純水に溶かし、水酸化ナトリウム10NでpHを8.0に調整し、最後に超純水で容量を1Lにします。室温で保存してください。
      注:常に新しく調製されたEDTA 20%pH 8.0を使用してください。水酸化ナトリウム(NaOH)10 Nは、400 gのNaOHを1 Lの超純水に溶解することによって調製されます。
   2. パラホルムアルデヒド(PFA)4%をドラフトで調製し、カルシウムとマグネシウムを含まない1x PBSを使用します。
      注:ヒュームフード内の濃縮パラホルムアルデヒド溶液またはパラホルムアルデヒド固形物を扱うための領域を指定し、そのようにラベル付けします。露出を避けるために、コンテナはできるだけ閉じたままにしてください。実施する実験に必要な最小限の実用的な量で使用してください。パラホルムアルデヒド粉末の計量と計量スケールをドラフトで使用できない場合は、まず容器を取り、次にフードとカバーにPFA粉末を追加してから、スケールに戻って粉末を計量します。常に作りたての4%PFAを使用してください。
   3. 各試験片に適した容器を使用してください。
      注:たとえば、1 mgの骨組織の場合、少なくとも1 mLの溶液が骨に接触できる容器を使用します。
   4. 解剖に必要なすべての手術器具を滅菌します。
   5. 除染液ですべての領域を清掃し、RNaseを除去します。
   6. 氷の容器、70%エタノールスプレーなどの残りの実験材料を収集し、オービタルシェーカーにアクセスできます。
2. マウスからの骨組織サンプルの単離
   1. CO₂ 曝露によってマウスを安楽死させ、次に頸部脱臼を行い、仰向けに置きます。マウスの皮膚に70%エタノールをスプレーします。
   2. 滅菌解剖ハサミを使用して、皮膚を開き、脚の筋肉を露出させます。脚に沿って筋肉を切って骨の位置をはっきりと見ることができ、骨を軽く離して損傷なく骨を取り除きます。
      注:骨に付着しているすべての筋肉を完全に取り除く必要はありません。RNAの分解を制限するために、できるだけ早く行動するようにしてください。
   3. すぐに骨サンプルを4%PFAを含むチューブに入れ、チューブを氷の上に置きます。
   4. 必要に応じて、手順を繰り返して他の骨サンプルを収集します。
   5. 4% PFAを攪拌したサンプルを、140 rpm、4°Cのオービタルシェーカーに少なくとも24時間置いて、適切に固定します。
3. 骨組織サンプルの脱灰
   1. 固定後、眼窩シェーカーから骨組織を回収します。
   2. 骨組織を1x PBSで1x PBSで2回、140rpmのオービタルシェーカーで3分間洗浄し、残っているPFAを取り除きます。
   3. 滅菌解剖ハサミを使用して、骨に付着している残りの筋肉をすべて取り除きます。
   4. 骨組織をもう一度1x PBSで3分間洗浄します。
   5. 骨組織を20%EDTAPH8.0の新しい容器に入れます。次に、容器を140rpmのオービタルシェーカーに室温(RT)で30分間置きます。
   6. 溶液を廃棄し、容器に新しい20%EDTA pH 8.0を加え、140rpmのオービタルシェーカーにRTで30分間置きます。
   7. 手順1.3.6を10回繰り返します。
   8. 溶液を廃棄し、容器に新鮮な20%EDTA pH 8.0を加え、140 rpmのオービタルシェーカーの冷蔵室で4°Cに一晩置きます。
4. 骨組織サンプルの脱水
   1. 容器から骨組織サンプルを取り出します。
   2. 組織を検査し、骨を静かに回してねじることにより、脱灰の効率を確認します。または、X線装置を使用して骨のX線撮影を行います。
      注:試料が簡単に曲がる場合は、良好なグレードの脱灰が達成されています。そうでない場合は、脱灰パラメータ(時間、撹拌速度、20% EDTA pH 8.0の使用量など)を増やす必要があります。
   3. 骨組織を1x PBSで3分間2回洗浄し、EDTAの残留物を取り除きます。
   4. 骨組織を新しい容器に入れ、70%エタノールで脱水を開始します。140rpmで15分間インキュベートします。
   5. 70%エタノール溶液を捨て、サンプルを90%エタノール溶液に入れ、140rpmで15分間インキュベートします。
   6. 90%エタノール溶液を捨て、サンプルを100%エタノールに入れ、140rpmで15分間インキュベートします。
   7. 100%エタノールを捨て、サンプルを新しい100%エタノールに入れ、140rpmで15分間インキュベートします。
   8. 100%エタノールを捨て、サンプルを新しい100%エタノールに入れ、140rpmで15分間インキュベートします。
   9. 100%エタノールを捨て、サンプルを新しい100%エタノールに入れ、140rpmで30分間インキュベートします。
   10. 100%エタノールを捨て、サンプルを新しい100%エタノールに入れ、140rpmで45分間インキュベートします。
       注:脱水症は、自動プロセッサを使用して実行することもできます。この場合は、手動脱水で報告されたのと同じ条件でプログラムを設定します。報告されている条件は、厚さが4 mm以下の標本(すなわち、マウスから得られた骨組織サンプル)に関するものである。厚さが4mmを超える試料の場合、脱水のタイミングを実験的に決定する必要があります。
5. 骨組織サンプルの清澄化
   1. 骨組織サンプルを新しい容器に入れ、キシレンを使用してクリアリングプロセスを開始します。140rpmで20分間インキュベートします。
   2. 使用済みのキシレンを廃棄し、新しいキシレンを加え、140rpmでさらに20分間インキュベートします。
   3. 使用済みのキシレンを廃棄し、新しいキシレンを加え、140rpmで45分間インキュベートします。
      メモ: クリアは、自動プロセッサを使用して実行することもできます。この場合は、マニュアル消込でレポートされた条件と同じ条件でプログラムを設定します。報告されている条件は、厚さが4 mm以下の標本(すなわち、マウスから得られた骨組織サンプル)に関するものである。4mmより厚い試験片の場合、タイミングを実験的に決定する必要があります。
6. 骨組織サンプルの浸潤と埋め込み
   1. クリアリング後、オービタルシェーカー/自動処理装置から骨組織サンプルを回収します。
   2. 骨組織サンプルを埋め込みカセットに入れ、ワックスで浸潤を開始します( 材料の表を参照)。60°Cで30分間インキュベートします。
   3. 使用済みのワックスを廃棄し、新しいワックスを加えて、60°Cで30分間インキュベートします。
   4. 使用済みのワックスを廃棄し、新しいワックスを加え、60°Cで45分間インキュベートします。
   5. 骨組織サンプルを希望の向きの型に慎重に置きます。
   6. 試験片ブロックが冷たい表面で固化するのを待ちます。
   7. 得られたFFPEは、切片化を開始する準備ができるまで4°Cで保存します。
      注:FFPEブロックは、セクショニングが行われる前に何年も保管できます。

2. 脱塩されていないFFPEサンプルの切片化に関するガイドライン

注:以下のガイドラインは、特に小さな未脱灰骨標本の場合にRNAの分解を回避しながら、組織切片の品質を大幅に向上させるのに役立つ貴重なヒントと指示を提供します。これらのガイドラインは、利用可能な場合は脱灰した骨標本にも適用できます。より大きな骨組織サンプルの場合、より高品質の切片を得るために脱灰を実施する必要があります。このような場合は、上記の方法に従い、それに応じてパラメータ(タイミング、溶液の量など)を調整する必要があります。以下のガイドラインは、FFPE骨組織がすでに処理されている場合(例:組織バンクや他のラボから採取したFFPEブロック)、または採取した切片を高品質のRNA、高品質の組織切片、またはその両方を必要とするあらゆるタイプの解析に利用する場合に適しています。

1. 機器の準備
   1. すべての作業面と器具に除染液をスプレーして、RNaseを除去します。
   2. 二重蒸留水でウォーターバスを準備し、温度を42°Cに設定します。
   3. ミクロトームブレードを取り、70%エタノールをスプレーして油の残留物を取り除き、次に除染液をスプレーしてRNaseを除去します。
   4. ブレードをミクロトームに固定します。クリアランス角度が10°に設定されていることを確認します。
      注意: セクショニングには、常に新しいブレードを使用してください。
   5. 氷のバケツを2つ用意します。
   6. ピンセット、ブラシ、プローブを用意し、除染液を噴霧してRNaseを除去し、2つのアイスバケツのいずれかに入れます。
   7. もう一方のアイスバケツに二重蒸留水を追加して、アイスバスを準備します。
      注:FFPEブロックは、追加された水に浮かぶべきではありません。したがって、アイスバケツに加える水の量は、サンプルが浮かずに濡れるのに十分な量でなければなりません。
2. セクショニング
   1. FFPEブロックを4°Cの保管庫から取り出し、ミクロトームに置きます。コマンドを Trimまたは スクロール厚さ14μmに設定し、組織が露出するまでサンプルのトリミングを開始します。
      注:FFPEブロックがすでにトリミングされており、組織がすでに露出している場合は、手順2.2.1をスキップします。ブロックに穴や亀裂がないことを確認します。その場合は、手順 2.2.2 に直接進んでください。そうでない場合は、いくつかのセクションを切り取って表面を平らにし、穴や亀裂を避けてから、手順2.2.2に進みます。
   2. FFPEブロックを氷浴に置き、サンプルを水和させます。水分補給の時間は実験的に決定する必要があります。
      1. 2分から始めて、水分補給が十分でない場合は時間を増やします。10分を超えないようにしてください。水分補給は組織を拡張し、「ベネチアンブラインド」とラインの形成を減らします。水分補給時間が長くなると、パラフィンブロックに亀裂が生じ、場合によっては組織が剥離する可能性があります。
      2. サンプルの水和に10分では不十分な場合は、10分以内に水和サイクルを実行し、再度切片化を試みます。
      3. 亀裂や切り傷によりブロックの表面が滑らかできれいでない場合は、サンプルを再埋め込むことを検討してください。RNAの品質は、再埋め込みプロセスによって影響を受けません。
   3. ミクロトームの試料クランプに試料を入れ、ブレードに位置合わせして切片作製を開始します。スクロールの厚さを5μmに設定します。
   4. 切片を採取し、冷たいピンセットとブラシを使用して42°Cのウォーターバスに入れます。
      注:あるいは、組織切片のRNA単離を行う場合は、切片を遠心分離チューブに集め、RNA調製の製造仕様に従ってください( 材料の表を参照)。
   5. 切片をウォーターバスでインキュベートして組織を伸ばし、残ったしわやひだを取り除きます。
      注:各セクションのウォーターバスに浮かぶ時間は、実験的に決定する必要があります。組織の剥離の問題が発生した場合は、骨切片を1分余分に残すことを検討してください。浮いている時間が長いと組織が損傷する可能性があるため、切片を長時間浮かせたままにしないでください。
   6. 切片をスライドガラスに置き、42°Cで3時間インキュベートします。
   7. スライドガラスをデシケーターまたはオーブンに室温で一晩置き、適切に乾燥させます。
   8. RTに取り付けられた部分のあるスライドガラスは、スライドボックスに保管します。
      注:スライドはRTで長年保存できます。スライドガラスの代わりに空間的トランスクリプトームを行う場合は、メーカーが提供する空間的遺伝子発現スライドに切片を配置し、報告されている推奨事項に従ってください( 材料の表を参照)。

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結果

ここで紹介する方法では、新たに分離した骨を処理して、RNAの完全性を維持しながらミクロトームで簡単に切片化できる脱灰FFPEサンプルを取得する方法について説明します(図1)。この方法はマウスの大腿骨に採用され、成功を収めていますが、同様の寸法の他の骨組織サンプルにも適用できますし、すべてのパラメータ(タイミング、溶液の量など)を増やすことで、よ?...

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ディスカッション

ここでは、脱灰した骨のFFPEブロックを調製し、シーケンシング(すなわち、次世代シーケンシング(NGS))または他のRNA関連技術(すなわち、 in situ ハイブリダイゼーション、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)など)のためにRNAの完全性を保持するための詳細な方法を提供します。

この方法では、EDTAを利用して骨組織サンプルを脱灰します。EDTAインキュベーシ?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced orbital shaker	VWR	76683-470	Use to keep tissues under agitation during incubation as reported in the method instructions.
Camel Hair Brushes	Ted Pella	11859	Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines.
Dual Index Kit TS Set A 96 rxns	10X Genomics	PN-1000251	Use to perform spatial transcriptomics.
Ethanol 200 Proof	Decon Labs Inc	2701	Use to perform tissue dehydration as reported in the method instructions.
Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate (EDTA)	Thermo Fisher Scientific	S312-500	Use to prepare EDTA 20% pH 8.0.
Fisherbrand Curved Medium Point General Purpose Forceps	Fisher Scientific	16-100-110	Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines.
Fisherbrand Fine Precision Probe	Fisher Scientific	12-000-153	Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines.
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15	Use to attach sectioned scrolls as reported in the guidelines.
High profile diamond microtome blades	CL Sturkey	D554DD	Use to section FFPE blocks as reported in the guidelines.
Novaseq 150PE	Novogene	N/A	Sequencer.
Paraformaldehyde (PFA) 32% Aqueous Solution EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15714-S	Dilute to final concentration of 4% with 1x PBS  to perform tissue fixation.
Phosphate buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010-049	Ready to use. Use to dilute PFA and to perform washes as reported in the method instructions.
Premiere Tissue Floating Bath	Fisher Scientific	A84600061	Use to remove wrinkles from FFPE sections as reported in the guidelines.
RNase AWAY Surface Decontaminant	Thermo Fisher Scientific	7002	Use to clean all surfaces as reported in the method instructions.
RNeasy DSP FFPE Kit	Qiagen	73604	Use to isolate RNA from FFPE sections once they have been generated as reported in the guidelines.
Semi-Automated Rotary Microtome	Leica Biosystems	RM2245	Use to section FFPE blocks as reported in the guidelines.
Sodium hydroxide	Millipore Sigma	S8045-500	Prepare 10 N solution by slowly dissolving 400 g in 1 liter of Milli-Q water.
Space Ranger	10X Genomics	2.0.1	Use to process sequencing data output .
Surgipath Paraplast	Leica Biosystems	39601006	Use to perform tissue infliltration and embedding as reported in the method instructions.
Visium Accessory Kit	10X Genomics	PN-1000194	Use to perform spatial transcriptomic experiments.
Visium Human Transcriptome Probe Kit Small	10X Genomics	PN-1000363	Use to perform spatial transcriptomic experiments.
Visium Spatial Gene Expression Slide Kit 4 rxns	10X Genomics	PN-1000188	Use to place the sections if performing spatial transcriptomic experiments.
Xylene	Leica Biosystems	3803665	Use to perform tissue clearing as reported in the method instructions.