幹細胞送達を用いた脊髄損傷の併用療法の開発

要約

この研究では、脊髄損傷修復のための脂肪由来幹細胞の再生促進挙動を調査し、活用するために利用できる神経模倣複合ハイドロゲルが開発され、特徴付けられました。

要約

外傷性脊髄損傷 (SCI) は、損傷部位の下に永久的な感覚運動障害を誘発します。米国では約25万人が罹患しており、公衆衛生上の懸念は計り知れません。効果的な治療法を提供するための研究が行われてきました。ただし、SCIは損傷部位の複雑な性質のため、依然として不治の病と考えられています。薬物送達、細胞移植、注射可能な生体材料など、さまざまな戦略が検討されていますが、1つの戦略だけでは再生の有効性が制限されます。そのため、最近、損傷の多面的な特徴を標的とすることができる併用療法が注目を集めています。細胞外マトリックス(ECM)は、SCIの細胞移植の有効性を高める可能性があることが示されています。この目的のために、脱細胞化脊髄(dSC)と坐骨神経(dSN)からなる3Dハイドロゲルを異なる比率で開発し、特性評価しました。dSCおよびdSNの組織学的解析により、細胞および核成分の除去が確認され、脱細胞化後も天然の組織構造が保持されました。その後、複合ハイドロゲルを異なる体積比で作製し、濁度ゲル化速度、機械的特性、および埋め込まれたヒト脂肪由来幹細胞(hASC)の生存率の分析を行いました。ハイドロゲルと脱細胞化脊髄マトリックスの比率の違いにより、機械的特性に有意差は認められませんでした。ゲルに埋め込まれたヒトASCは、14日間の培養を通じて生存率を維持しました。この研究は、神経特異的なECMおよび再生促進性間葉系幹細胞を提示する組織工学的コンビナトリアルハイドロゲルを生成する手段を提供します。このプラットフォームは、SCI後の神経再生戦略と将来の研究に関する新たな洞察を提供することができます。

概要

約296,000人が外傷性SCIに苦しんでおり、毎年約18,000人の新しいSCI症例が米国で発生しています¹。外傷性SCIは、一般的に転倒、銃創、車両事故、スポーツ活動によって引き起こされ、多くの場合、損傷部位の下の感覚運動機能の永久的な喪失を引き起こします。SCI治療の推定生涯費用は、個人あたり100万ドルから500万ドルの範囲であり、平均余命は大幅に短くなっています¹。しかし、SCIはまだよく理解されておらず、主に損傷後の複雑な病態生理学的結果のために、ほとんどが不治の病^です2。細胞移植や生体材料ベースの足場など、さまざまな戦略が研究されています。細胞や生体材料の移植は可能性を示していますが、SCIの多面的な性質は、組み合わせアプローチがより有益である可能性があることを示唆しています³。その結果、多くの組み合わせ戦略が研究され、個々のコンポーネントよりも優れた治療効果が実証されています。しかし、細胞や薬物を送達するための新しい生体材料を提供するためには、さらなる研究が必要です³。

天然ハイドロゲルを作製するための有望なアプローチの1つは、組織の脱細胞化です。脱細胞化のプロセスでは、イオン性、非イオン性、物理的、および組み合わせ的な方法を利用して、ECM成分を維持しながら、すべてまたはほとんどの細胞および核物質を除去します。細胞成分のすべてまたは大部分を除去することにより、ECM由来のハイドロゲルは、移植/注入後の宿主に対する免疫反応性が低くなります⁴。脱細胞化組織の品質を評価するために測定すべきいくつかのパラメータがあります:細胞/核内容物の除去、機械的特性、ECMの保存。有害な免疫反応を避けるために、次の基準が確立されています:1)ECM乾燥重量mgあたり50 ngの二本鎖DNA(dsDNA)未満、2)DNA断片の長さが200 bp未満、および3)4'6-ジアミジノ-2-フェヌイリンドール(DAPI)⁵で染色された目に見える核物質がほとんどまたはまったくないこと。機械的特性は、引張試験、圧縮試験、および/またはレオロジー試験によって定量化でき、それらは元の組織⁶と同様であるべきである。さらに、タンパク質の保存は、脱細胞化組織の主要成分、例えば、ラミニン、グリコサミノグリカン(GAG)、脊髄のコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)に焦点を当てたプロテオミクスまたは定量アッセイによって評価することができます^7,8。検証済みのECM由来ハイドロゲルは、細胞ベースの治療を支援するために、さまざまな種類の細胞で再細胞化することができます⁹。

SCI修復については、シュワン細胞、嗅覚被覆細胞、骨髄由来間葉系幹細胞(MSC)、神経幹細胞/前駆細胞など、さまざまな細胞タイプが研究されています10,11,12。しかし、これらの細胞の臨床使用は、倫理的な懸念、隣接する細胞/組織とのまばらな統合、高収量のための組織源の欠如、自己更新が不可能であること、および/または増殖能力が限られていることなどにより、制限されている13,14,15。これらの細胞型とは異なり、ヒト脂肪由来MSC(hASC)は、脂肪吸引物を用いて低侵襲的に容易に単離でき、多数の細胞を得ることができるため、魅力的な候補である¹⁶。さらに、hASCは、神経保護、血管新生、創傷治癒、組織再生、および免疫抑制の可能性を有する成長因子およびサイトカインを分泌する能力を有する17,18,19,20,21。

説明したように、複数の研究が実施されてきました 22,23,24、そしてそれらから多くのことが学ばれてきましたが、SCIの不均一な特性は、機能回復を促進する上での有効性を制限しています。そのため、SCIの治療効果を高めるために、組み合わせアプローチが提案されています。本研究では、脱細胞化した脊髄と坐骨神経を組み合わせて複合ハイドロゲルを作製し、3次元(3D)hASC培養を行いました。脱細胞化の成功は、組織学的およびDNA分析によって確認され、神経複合ヒドロゲルの異なる比率は、ゲル化速度論および圧縮試験によって特徴付けられました。神経複合ハイドロゲルにおけるhASCの生存率を調査し、このハイドロゲルが3D細胞培養プラットフォームとして利用できることを証明しました。

プロトコル

ブタの組織は商業的に入手されたため、動物倫理委員会による承認は必要ありませんでした。

1. ブタの脊髄の脱細胞化(推定期間:5日間)

注:以前に確立されたプロトコルを使用して、^修飾25,26を使用して脱細胞化を実行します。すべての手順は、特に明記されていない限り、室温の滅菌バイオセーフティキャビネットで行う必要があります。すべての溶液は、ボトルトップフィルター(0.2 μmの細孔サイズ)を使用してオートクレーブ滅菌ボトルに滅菌ろ過する必要があります。37°Cで実施する手順は、インキュベーター内または37°Cに設定された清潔なオーブン内で行うことができます。

1. 脱細胞化溶液の調製
   注:すべての溶液は1 Lで計算され、ユーザーは実験のニーズに応じて最終的な必要量を調整する必要がある場合があります。
   1. 500 mLの0.05%トリプシン/エチレンジアミン四酢酸(EDTA)を500 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で希釈して、0.025%トリプシン/ EDTAを作成します。.
   2. 10% Triton X-100 300 mL を PBS 700 mL で希釈して、3% Triton X-100 を調製します。0.56 gのNaCl、1.31 gのNaH₂PO₄H₂O、および10.85 gのHNa₂O₄P·7H₂Oを1 Lの脱イオン水に混合して、100 mM Na/50 mMのphosバッファーを調製します。
   3. 1Lの脱イオン水に32.4gのスクロースを混ぜて、1Mのスクロースを作ります。40 gのデオキシコール酸ナトリウム(SD)を1 Lの脱イオン水に混合して、4%SD溶液を作ります。6.7 mLの15%過酢酸を993.3 mLの4%エタノールで希釈します。.
2. ブタの脊髄の調製
   注:脊髄は溶液なしで冷凍され、使用するまで-80°Cに保たれました。
   1. 脊髄を冷蔵庫で4°Cで18〜24時間解凍してから脱細胞化します。滅菌ハサミを使用して、硬膜を慎重に取り除きます。
   2. 脊髄を小片(長さ約1cm)に切ります。1個を15mLのチューブに入れるか、最大3個を50mLのチューブに入れます。
3. 脊髄の脱細胞化
   注:各ステップの後、脱細胞化溶液を大きなビーカーに手動で注ぎ、廃棄します。小型のオートクレーブ可能なステンレス製ストレーナーは、各ステップに必要な組織を失うことなく、脱細胞化溶液を廃棄するために使用できます。脊髄は、特に明記されていない限り、83rpmで攪拌しました。
   1. 脊髄を脱イオン水で4°Cおよび60rpmで18〜24時間すすぎます。
   2. 脊髄を0.025%トリプシン/EDTAで37°C、40rpmで1時間すすぎます。次に、脊髄をPBSで15分間、2回すすぎます。
   3. 脊髄を3% Triton X-100で2時間洗い流します。脊髄を100 mM Na/50 mM phosバッファーで15分間、2回すすぎます。
   4. 脊髄を1Mショ糖で1時間洗い流します。次に、脊髄を脱イオン水で1時間すすぎます。
   5. 脊髄を4%SDで2時間すすぎます。次に、脊髄を100 mM Na/50 mM phosバッファーで15分間、2回すすぎます。
   6. 脊髄を4%エタノール中の0.1%過酢酸で4時間すすぎます。次に、脊髄をPBSで1時間すすぎます。
   7. 脊髄を脱イオン水で1時間、2回すすぎます。次に、脊髄をPBSで1時間すすぎます。
   8. 脊髄を0.01 mbarおよび-56°Cで3日間凍結乾燥し、使用するまで乾燥させて保存します。

2. ブタ坐骨神経の脱細胞化(推定期間:5日間)

注:以前に確立されたプロトコル²⁷を使用して脱細胞化を実行します。すべての手順は、特に明記されていない限り、室温の滅菌バイオセーフティキャビネットで行う必要があります。すべての溶液は、ボトルトップフィルター(0.2 μmの細孔サイズ)を使用してオートクレーブ滅菌ボトルに滅菌ろ過する必要があります。37°Cで実施する手順は、インキュベーター内または37°Cに設定された清潔なオーブン内で行うことができます。

1. 脱細胞化溶液の調製
   注:すべての溶液は1 Lで計算され、ユーザーは実験のニーズに応じて最終的な必要量を調整する必要がある場合があります。
   1. 1 Lの脱イオン水に1.86 gのNaCl、0.262 gのd NaH₂PO₄H₂O、および2.17 gのHNa₂O₄P·7H₂Oを混合して、50 mM Na/10 mM phosバッファーを調製します。
   2. 125 mM スルホベタイン-10 (SB-10) 溶液を調製するには、38.4 g の SB-10 を 1 L の 50 mM Na/10 mM phos バッファーに混合します。
   3. 50 mM Na/10 mM phos緩衝液1 L中に30 gのSDと0.24 gのSB-16を混合して、3 % SD/0.6 mM sulfobetaine-16 (SB-16)溶液を調製します。
2. ブタ坐骨神経の調製
   注:坐骨神経はPBSで凍結され、使用まで-80°Cに保たれました。
   1. 脱細胞化の18〜24時間前に冷蔵庫で4°Cで坐骨神経を解凍します。
   2. 坐骨神経を小片(長さ約1cm)に切ります。1個を15mLのチューブに入れるか、最大3個を50mLのチューブに入れます。
3. 坐骨神経の脱細胞化
   注:各ステップの後、脱細胞化溶液は廃棄される大きなビーカーに手動で注がれ、小さなオートクレーブ可能なステンレス鋼ストレーナーを使用して、各ステップに必要な組織を失うことなく脱細胞化溶液を廃棄することができます。坐骨神経は、特に明記されていない限り、15rpmで動揺されました。
   1. 坐骨神経を脱イオン水で7時間洗い流します。次に、坐骨神経を 125 mM スルホベタイン-10 (SB-10) で 50 mM Na/10 mM phos バッファーで 18 時間洗い流します。
   2. 坐骨神経を100 mM Na/50 mM phos緩衝液で15分間洗い流します。次に、坐骨神経を 3% SD/0.6 mM スルホベタイン-16 (SB-16) で 50 mM Na/10 mM phos バッファーで 2 時間すすぎます。
   3. 坐骨神経を100 mM Na/50 mM phos緩衝液で15分間、3回すすぎます。次に、坐骨神経を 125 mM SB-10 で 50 mM Na/10 mM phos バッファーで 7 時間すすぎます。
   4. 坐骨神経を100 mM Na/50 mM phos緩衝液で15分間洗い流します。次に、坐骨神経を 3% SD/0.6 mM SB-16 で 50 mM Na/10 mM phos バッファーで 1.5 時間すすぎます。
   5. 坐骨神経を50 mM Na/10 mM phos緩衝液で15分間、3回洗い流します。次に、坐骨神経を75 U / mLのデオキシリボヌクレアーゼ(DNase)で3時間攪拌せずにすすぎます。.
   6. 坐骨神経を50 mM Na/10 mM phosバッファーで1時間、3回すすぎます。次に、坐骨神経を0.2 U / mLのコンドロイチナーゼABCで37°Cで16時間攪拌せずにすすぎます。.
   7. 坐骨神経をPBSで3時間、3回すすぎます。坐骨神経を0.01 mbarおよび-56°Cで3日間凍結乾燥し、使用するまで乾燥させて保存します。

3. 脱細胞化組織の消化と複合ハイドロゲルの作製(所要時間:4日)

1. 脱細胞化した組織をハサミまたはホモジナイザーを使用して粉末に切り刻むか粉砕します。ツールを滅菌して、オートクレーブを使用して121°Cで45分間組織を刻むか粉砕します。エチレンオキシド法も適用可能です。
2. 1 mg/mL の濃度で 1 mg/mL のペプシンを含む 0.01 N 塩酸 (HCl) 溶液で組織を別々に消化します。脱細胞化脊髄と坐骨神経の推定重量は、それぞれ1個あたり50〜100mgと100〜150mgです。
3. マグネットバーを置き、500rpm、4°Cで少なくとも4日間攪拌してプレゲル溶液を生成します。
4. 坐骨神経と脊髄プレゲルを次の体積比で混合します:2:1、1:1、および1:2。1 Nの水酸化ナトリウム(NaOH)とHClを使用してpH 7.4を調整し、M199培地と1x PBSを使用して目的の濃度に希釈します。37°Cで30分間インキュベートします。
   注:NaOHを一度に1μLずつ加えます。M199培地は、pHが7.4のときに淡いピンク色に変わるため、pH指示薬として使用できますが、pHレベルを確認するためにpHストリップを使用する必要があります。

4. 脱細胞化の検証

1. ヘマトキシリンおよびエオシン染色(H&E;所要時間:8日)
   注:各すすぎステップの後、溶液は手動で大きなビーカーに注がれて廃棄されます。
   1. 新鮮で脱細胞化された脊髄と坐骨神経を3.7%ホルムアルデヒドに4°Cで18時間固定します。15mLのチューブに1個を入れます。
   2. ホルムアルデヒドを除去し、組織を10%ショ糖に1日間置きます。10%スクロースを取り除き、組織を30%スクロースに6日間置きます。
   3. 適切なサイズのクライオモールドを最適な切断温度(OCT)で半分まで充填します。脱細胞化した組織を留置し、OCTで覆い、OCTを1日間吸収させます。
   4. 1日後、組織を-80°Cで一晩凍結します。 クライオスタットを使用して、組織を厚さ10μmで凍結切片します。
   5. 1x PBSで5分間、2回すすぎます。その後、水道水で5分間すすぎます。
   6. ヘマトキシリン溶液で1分間染色します。水道水で1分間、3回すすいでください。
   7. エオシン溶液で1分間染色します。95%エタノールで1分間、2回、100%エタノールで1分間、3回すすぎます。
   8. キシレンで1分、2分、1分ですすいでください。スライドを5分間乾かします。
   9. 綿棒を使用して、3〜4滴のジブチルフタル酸ポリスチレンキシレン(DPX)マウント溶液をスライドに滴下します。カバーガラスをDPXで覆われたスライドの上に置きます。スライドを一晩乾かします。
2. DNA解析(所要時間:1時間)
   1. 脱細胞化組織と凍結乾燥組織を秤量します。製造元の指示に従って、市販のキットを使用してDNAを単離および定量します。

5. 複合ハイドロゲルの特性評価

1. ゲル化濁度試験(推定時間:1時間)
   1. 氷上の96ウェルプレートの各ウェルに100 μLのプレゲル溶液を入れます。プレートリーダーを使用して、2分ごとに405nmの吸光度を45分間読み取ります。
   2. 次の式を使用して正規化された吸光度を計算します。
      (吸光度 -_初期吸光度) / (_最大吸光度 -_初期吸光度)
   3. 曲線の傾きと、50%と95%のゲル化を達成するまでの時間、それぞれt_1/2 とt₉₅を計算します。
2. 圧縮試験(推定時間:ハイドロゲルあたり1分)
   1. 12 mg/mL の濃度で、直径 8 mm、高さ 2 mm の複合ハイドロゲルを作製します。
   2. レオメータを使用して、ステンレス製平行プレート間に250 Nの負荷でサンプルを圧縮し、サンプル高さ/分の10 %のひずみ速度で圧縮します。レオメータの読み取り値を提供するソフトウェアは、力を加えてヒドロゲルが壊れるまでひずみを測定することにより、応力-ひずみ曲線を提供します。
   3. ヤング率は、応力-ひずみ曲線の線形領域の傾きから計算します。

6. 神経複合ハイドロゲルにおけるヒトASCの三次元培養

1. 3次元(3D)プラットフォームの準備(所要時間:3時間)
   1. シリコンウェーハにSU-8フォトレジストをエッチングし、深さ200μm、直径4mmの円形パターンを作製します。
   2. ポリジメチルシロキサン(PDMS)塩基と硬化剤を10:1の比率で混合します。混合物をシリコンウェーハに注ぎ、20分間放置して、PDMSベースと硬化剤の混合から発生するすべての気泡を取り除きます。
   3. オーブンに入れ、70°Cで2時間硬化させます。 硬化したPDMSシートを型から外し、直径8mmのバイオプシーパンチを使用してパンチアウトし、PDMSマイクロウェルを作製します。
   4. マイクロウェルを96ウェルプレートに入れ、ウェルプレートをエアプラズマクリーナーに入れてPDMSマイクロウェルを滅菌します。
   5. PDMSマイクロウェルを1%ポリエチレンイミン(PEI)および0.1%グルタルアルデヒド(GA)でそれぞれ10分間および20分間官能基化します。マイクロウェルを蒸留水で2回洗浄します。
2. hASCの調製(予定時間:7日)
   1. hASC増殖培地(hASCs基礎培地にウシ胎児血清(FBS)およびペニシリン/ストレプトマイシン(Pen-strep)を添加)で2〜5継代、継代細胞をコンフルエントになるまで培養します。血球計算盤またはセルカウンターを使用して細胞数を継代し、計算します。
3. ASCを含んだ神経複合ハイドロゲル(推定時間:2時間)
   1. 坐骨神経と脊髄プレゲルを2:1、1:1、1:2の体積比で混合し、坐骨神経プレゲルを混合せずに脊髄のみのハイドロゲルを調製します。
   2. M199培地を添加し、1 N NaOHおよびHClを使用してpH 7.4に調整し、hASCを増殖培地と共にプレゲル内に1 x 10⁶ 細胞/mLの密度で再懸濁します。
      注:M199および細胞懸濁液の量は、プレゲルの10%であるべきである。
   3. 1x PBSを使用してプレゲルを12 mg/mLに希釈します。プレゲルをマイクロウェルに置き、30分間インキュベートします。ASCを多く含むハイドロゲルをhASC増殖培地で培養します。
4. 細胞生存率試験(推定時間:1日あたり4時間)
   1. 製造元の指示に従って、市販の試薬を使用して生存率試験溶液を調製します。
   2. 1日目、4日目、7日目、14日目に培地を吸引します。試薬をウェルに添加し、製造元の指示に従って37°Cで3時間インキュベートします。
   3. プレートリーダーを使用して、560/590 nmの励起/発光で蛍光を読み取ります。次の式を使用して差の割合を計算します。
      [(蛍光_試料-蛍光_ブランク)/蛍光_ブランク]×100

結果

脱細胞化組織は、わずかに変更を加えた以前に確立されたプロトコルを使用して調製されました^26,27。脱細胞化、凍結乾燥、消化後、SN:SC = 2:1、1:1、1:2の比率の神経複合ハイドロゲル、および脊髄のみのハイドロゲルを作製しました(図1)。核成分の除去は、H&E染色によって確認されました(

ディスカッション

SCIの病態生理学は複雑で多面的であると広く信じられています。細胞移植、薬物送達、生体材料などの単一の治療法がそれぞれSCIに貴重な洞察を提供してきたにもかかわらず、SCIの複雑な性質は個々の有効性を制限する可能性がある28,29,30,31。そのため、効果的なコンビ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-(Decyldimethylammonio)propane sulfonate inner salt	Sigma-Aldrich	D4266	Used during sciatic nerve decellularization, SB-10
3-(N,N-Dimethylpalmitylammonio)propane sulfonate	Sigma-Aldrich	H6883	Used during sciatic nerve decellularization, SB-16
AlamarBlue reagent	Fisher Scientific	DAL1100	Used during AlamaBlue cell viabiiltiy test
Chondroitinase ABC	Sigma-Aldrich	C3667	Used during sciatic nerve decellularization
Cryostat	Leica	CM1860
Deoxyribonuclase	Sigma-Aldrich	D4263	Used during sciatic nerve decellularization
Disodium hydrogen phosphate heptahydrate	VWR	BDH9296	Chemical for 100 mM Na/50 mM phos and 50 mM Na/10 mM phos buffer
DNeasy Blood & Tissue kit	Qiagen	69506	Used during DNA analysis
Dpx Mountant for histology,slide mounting medium	Sigma-Aldrich	6522	Used during H&E staining
Eosin	Sigma-Aldrich	HT110216	Used during H&E staining
Ethanol	VWR	89125-172
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	252549	Used during H&E staining
Glutaraldehyde (GA)	Sigma-Aldrich	G6257	Used during PDMS surface functionalization
hASC growth media	Lonza	PT-4505	Used to culture hASCs, containing of fetal bovine serum and penicilin/streptomycin
Hematoxylin	VWR	26041-06	Used during H&E staining
human adipose-derived stem cell	Lonza	PT-5006
Hydrochloric acid (HCl)	Sigma-Aldrich	320331	Used to digest decellularizied tissues and adjust pregels solutions
M199 media	Sigma-Aldrich	M0650	Used to dilute pregels to desired concentration
Optimal cutting temperatue compound	Tissue-Tek	4583
Pepsin	Sigma-Aldrich	P7000	Used to digest decellularized tissues
Peracetic acid	Lab Alley	PAA1001	Used during spinal cord decellularization
Phosphate buffered saline (PBS)	VWR	97062-948
Plate reader	BioTek Instruments	Synergy Mx
Polyethyleneimine (PEI)	Sigma-Aldrich	181978	Used during PDMS surface functionalization
Porcine sciatic nerve	Tissue Source LLC		Live pigs, with no identifiable information and no traceability details
Porcine spinal cord	Tissue Source LLC		Live pigs, with no identifiable information and no traceability details
QuantiFluor dsDNA system	Promega	E2670	Used to analyze DNA contents
Rheometer	TA Instruments	DHR 2
Rugged rotator	Glas-co	099A RD4512	Used during spinal cord decellularization
Sodium chloride (NaCl)	VWR	BDH9286	Chemical for 100 mM Na/50 mM phos and 50 mM Na/10 mM phos buffer
sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate	VWR	BDH9298	Chemical for 100 mM Na/50 mM phos and 50 mM Na/10 mM phos buffer
Sodium hydroxide solution (NaOH)	Sigma-Aldrich	415443	Used to adjust pregels solutions
SU-8	Kayaku advnaced materials	SU8-100	Used to coat silicon wafer
Sucrose	Sigma-Aldrich	S8501	Used during spinal cord decellularization
Sylgard 184 silicone elastomer kit	DOW	1317318	Polydimethylxiloxane (PDMS) base and curing agent
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	Used during spinal cord decellularization
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher	25300062	Used during hASC work and during spinal cord decellularization
Tube revolver rotator	Thermo Fisher	88881001	Used during sciatic nerve decellularization
Xylene	VWR	MK866816	Used during H&E staining