ラットにおけるステロイド誘発性大腿骨頭骨壊死の張力フリー体重負荷モデル

要約

このプロトコルは、弾性治療テープを使用して、ステロイド誘発性大腿骨頭骨壊死のためのシンプルで費用対効果の高いラット体重負荷トレーニングモデルの構築を示しています。

要約

ネズミは人間と違って四つん這いで歩く動物ですが、人間は立つ二足歩行の動物で、歩いたり立ったりするときに腰に大きな圧力がかかります。ラットステロイド誘発性大腿骨頭壊死モデルでは、高圧下でのヒト股関節の生体力学的特性をシミュレートする必要があることがよくあります。一部の学者は、ラットに一定の体重を負担させることで人間の股関節の圧力の状態を模倣しようとしますが、体重を支える物体をラットに固定するのは困難です。ネズミは簡単に動けなくなるので、粘着テープでネズミに重りを貼り付けると、ネズミは窒息したり、腸閉塞で死亡したりします。私たちの研究グループは、弾性治療テープを用いてラットの体重を支える物体を張力なく固定することで、ラットが自由に呼吸でき、体重負荷条件下での固定から離れないようにしました。通常のステロイド誘発性大腿骨頭壊死ラットモデルと比較して、この体重負荷介入はラットの大腿骨頭壊死の進行を悪化させる可能性があることを発見しました。

概要

グルココルチコイドの投与は、大腿骨頭の非外傷性骨壊死 (ONFH^{) の}最も一般的な危険因子です1。多くの証拠は、グルココルチコイドに加えて、患者の股関節への圧力負荷もONFHの発生に関連していることを示唆しています。体重や肉体労働強度などの要因がONFH2のリスク要因として認識されています。複数の臨床研究により、股関節の負荷状態と関節置換術のタイミングと発生率との間に密接な関係があることが示されています 3,4,5,6。したがって、荷重負荷とステロイド誘発性大腿骨頭骨壊死 (SONFH) との関係を反映するモデルを確立することは、この状態を包括的に調査するために重要です。

ダチョウやエミューなどの大型の二足歩行の鳥は、人間の脚の負荷^7,8に似た股関節のストレスをシミュレートするための優れたモデルとして機能します。しかし、大型の鳥類を維持することは困難であり、関連する研究費は高額です。自然高血圧ラットモデル^9,10は、より高いONFH率を示すことができるが、自然高血圧によって生成される骨髄内のコンパートメント圧力負荷は機械的圧力とは大きく異なり、SONFHに対する機械的圧力の影響を研究するには適していない。

SONFHの研究には、小動物モデルがよく使われます。しかし、四足歩行の爬虫類は股関節のストレスが低く、その股関節モデルでは二足歩行中のヒトの股関節の生体力学的環境をシミュレートすることはできません。片肢固定モデル¹¹ と部分除荷モデル¹² が一般的ですが、どちらも肢負荷を軽減します。人間は立ったり歩いたりするときに下肢にかなりの負荷がかかる二足歩行生物であるため、これらのモデルで負荷を減らすと、動物モデルと人間の病気との関係が減少します。

この研究は、ラットの大腿骨頭のステロイド誘発性骨壊死に対する体重負荷トレーニングの影響を調査するための、体重負荷トレーニングのシンプルで費用対効果の高いモデルを確立することを目的としています。現在、ラットモデルは、ステロイド誘発性大腿骨頭の骨壊死を研究するために使用されてきました^13,14が、動きの中断を最小限に抑えて長期的で安全な固定を提供できるモデルはまだありません。本研究では、張力のない固定を採用した高接着性固定材を塗布することで、ラットの可動性を維持し、不適切な固定による苦痛や死亡さえも軽減します。

プロトコル

このプロトコルは、北京中医薬大学の動物管理・使用委員会(IACUC)が定めた倫理ガイドラインに準拠しています(プロトコル番号:BUCM-4-2022062001-2109)。このプロトコルは、8〜10週齢、体重200g〜250gのSprague Dawley(SD)ラット(SCXK(Jing)2019-0008)を使用します。

1. 適応研修

1. アルビノラットの視覚範囲は一般に60 cm¹⁵未満です。モデリングプロセスでは、ラットを不透明なケージに入れ、モデル化されていないラットからできるだけ離して(少なくとも、他のラットはモデル化されたラットの最大視覚範囲外にいる必要があります)、トラウマ性ストレスを経験するのを防ぎます。
2. 電源を入れ、トレッドミルを10°の傾斜で0m / minに設定します。ラットをトレッドミルに置き、ストレスを避けるために動きができるだけ穏やかであることを確認してください。追加の刺激は使用しないでください。ネズミは環境に慣れていないため、自然に前方に這い進みます。
3. トレーニングは15分間続きます。訓練後は、ネズミが残した糞尿を片付け、アルコールを噴霧して動物の臭いを消します。次に、次のラットをトレーニング用に準備します。
   注:ラットがトレッドミルで5分間歩くことを拒否した場合は、研究から除外します。
4. 1^週 目の終わりまで適応トレーニングを続けます。

2. ラットの最大耐体重測定

1. 試験管2本、フック、長さ約80cmのループファスナーを用意します。試験管に鋼球を入れ、試験管、フック、ループファスナーの初期合計重量が150gになるようにします。総重量の異なる試験管を10g刻みで準備し、最大重量は350gです。
2. 研究者が手袋を使って両手でネズミを固定します(図1)。別の研究者は、背中の正中線から約1cm離れたラットの背中に試験管を置きます。このステップはラットの動きを必要としないため、チューブを固定するための追加の手段を使用せずに、フックとループの留め具をラットに巻き付けるだけで固定を行います。
3. ラットの最大体重に達するまでチューブを交換してください。ラットが最大体重を支えるようになったとき、突かれたり実験者が去ったりすると、ラットは立っていられなくなります。ラットが立つことができるように、重量を10 g減らします。この重量は、ラットの最大耐荷重を表します。

3. 重量負荷の準備

1. トレーニング中はしっかりと固定する必要があるため、密着力の強いラットサイズに基づく1〜1.5mの弾性治療用テープを使用して物体を固定します。粘土を使用して試験管の重量を調整し、負荷の揺れを減らします。
2. 試験管と固定物の重量を量った後、試験管に適量の粘土を加えて目標重量に調整します。ガラス攪拌棒を使用して、試験管内に粘土を均等に広げます。試験管の一端に粘土が集中していると、トレーニング中に試験管が簡単に剥がれる可能性があります。
3. 調整した試験管と粘土の総重量をラットの最大耐荷重の50%に調整します(図1A)。この重量を超えると、ラットがトレーニングを完了するのが難しくなります。実験が終了するまで、負荷の重量を再度調整しないでください。

4. ステロイド誘発性大腿骨壊死の確立

1. SONFHモデル確立^16,17には、メチルプレドニゾロンとリポ多糖(LPS + MPS)法を組み合わせて使用します。ラットの腹部の正中線に標準的な針を使用してLPS(20μg / kg)の腹腔内注射を24時間に1回、合計2回注射します。
2. 最後の LPS 注射後、定期的な摂食の 24 時間後に片側臀筋に MPS (40 mg/kg) を注射し、2 つの臀部領域を交互に 24 時間ごとに続けて、合計 3 回の注射を行います。

5. 伸縮性のある治療用テープとトレッドミルトレーニングを使用した張力のない体重負荷固定

1. ラットの背中の正中線を両側で1〜2cmにマークします。これは、重量荷重の基準点です。トレッドミルトレーニング中にラットが転倒したり動きを妨げたりしないように、マークが適切に配置されていることを確認してください。
2. 1人の研究者が手袋を使用してラットを固定し、片方の手をラットの脇の下に置いて前肢と顎を固定し、もう一方の手で後肢と尾を固定します。ストレスや窒息を防ぐために、過度の力は避けてください(図1B)。
3. 弾性治療テープを張力をかけずに試験管に接着して、ラットの背中に負荷を固定します。巻き取りの過程で、張力のない固定を実現するために弾性治療テープを伸ばさないでください。
   注:このモデルで使用されている弾性治療用テープは、激しい身体活動中のテーピング用に設計されており、高い接着性と弾力性を提供します¹⁸。弾力性が高いため、這う際のネズミの動きへの影響を大幅に軽減します。
4. 2 番目の研究者に、試験管をラットの背骨と平行にラットの背中に固定し、マーキングに基づく固定位置、つまりラットの背中の両側の正中線から 1 〜 2 cm 離すように依頼します。
5. ラットの苦痛を最小限にとどめ、ラットの動きへの影響を減らし、固視による死亡率を減らすためには、張力をかけずに固執を行います。重量を調整した試験管を弾性治療テープに貼り付け、テンションフリーの技術を使用して試験管をラットの体に巻き付けます。
6. ラットの呼吸や動きに悪影響を及ぼさないように、張力のない固定を確保し、伸縮性のある治療テープの元の長さを伸ばさないようにします(図1C)。
7. 試験管をラットの体に巻き付けた後、ラットをオープンスペースまたは単一のケージに置き、呼吸と方向を監視します。急速な呼吸や口の開きの兆候が現れた場合は、窒息を防ぐためにラットを速やかに解放してください。
   1. 理想的な固定化により、ラットは自由に動き回り、飲酒、前肢の持ち上げ、摂食などの活動を行うことができます(図1D)。固定化が不十分な場合は、一時的に解放し、20分後に再度固定化することで、固定化刺激の繰り返しによるラットへのストレスを最小限に抑えます。
8. 電源を入れ、トレッドミルを1°の傾斜で0m / minに設定します。トレッドミルのトレーニング時間は30分です。ラットをトレッドミルにそっと移し、タイマーを開始します。
9. ラットに追加の刺激を与えないでください。ラットが30分間のトレーニングを完了できない場合は、固定を解除せずにケージに入れて10分間休ませます。
   注: この研究で使用した弾性治療用テープは、優れた伸縮性と接着性を備えています。張力をかけずに適切に固定すれば、長期間の固定により試験管が外れたり、ラットが窒息したり死亡したりすることはありません。
10. 訓練後は、ネズミが残した糞尿を片付け、アルコールを噴霧して動物の臭いを消します。
11. 上記の手順が他のラットに見られるのを避け、動物が発声して他のラットにトラウマ性ストレスを引き起こすのを防ぐために、動物をできるだけ優しく扱います。
12. トレーニング終了後、すぐにラットを固定から解放します(図1E)。リリース中は、指を使ってラットの毛皮を押し下げて保護し、リリース中の毛皮の損失を最小限に抑えます(図1F)。

6.動物のグループ化

1. 体重負荷トレーニングがSONFHに与える影響を研究するには、60匹のラットをランダムに4つのグループに分けます。
2. 対照群では、一般的なステロイド誘発性大腿骨頭骨壊死 (SONFH) モデルを確立したり、体重負荷トレーニングを行ったりしないでください。Control + Loadグループでは、大腿骨頭モデルのステロイド誘発性骨壊死を確立せずに、体重負荷トレーニングのみを実施します。モデルグループでは、大腿骨頭モデルのみのステロイド誘発性骨壊死を確立します。Model + Loadグループでは、大腿骨頭モデルのステロイド誘発性骨壊死を確認した後、体重負荷トレーニングを実行します。

7.安楽死と標本収集

1. ラットを小動物の安楽死チャンバーに入れ、5%を超える濃度を達成するのに十分な二酸化炭素を注入します。ラットが意識を失ったら、心臓内注射により、20%塩化カリウム溶液(合計20 mL)を体重0.3 mL / kgの用量で投与します。.
2. ラットの呼吸と心拍を監視して、安楽死中に痛みや不快感を感じないことを確認します。呼吸と心拍がないことを確認して死亡を確認します。アルコールをスプレーして臭いを洗い流します。
3. 安楽死後、ラットの股関節領域を解剖し、大腿骨を無傷に保ちながら大腿骨頭を摘出します。前処理後にマイクロCTスキャンを行い、続いてヘマトキシリン-エオシン(HE)染色を行います。

8. ヘマトキシリン-エオシン染色

1. モデリングが完了したら、ラットを安楽死させます。HE染色のために大腿骨を取り外してください。
2. ラットの大腿骨を4%パラホルムアルデヒドに24時間浸し、生体組織を標本として保存します。ラット大腿骨標本を5%ギ酸に浸して5日間脱灰します。
3. 試料を5 μmのスライスに切片化してHE染色します。
   注:空の裂孔とは、骨組織¹⁹において、通常は骨細胞を含むはずの裂孔がこれらの細胞を欠いている状況を指す。これは、骨組織の健康状態を評価するための重要な指標です。骨壊死の病理学的過程では、血液供給が不十分な場合、骨細胞が死に至り、空洞が生じる可能性があります。骨壊死の診断と評価では、空の裂孔の数と分布は、疾患の重症度を測定するための重要なパラメータです^20,21。
   1. ラットの大腿骨標本を溶融パラフィン(56-60°C)に入れ、必要に応じて最初に低融点パラフィンに浸し、次に約1時間ごとに高融点パラフィンに徐々に移し、パラフィンによる組織の完全浸透を確保します。
   2. 埋め込み型を準備し、溶かしたパラフィンを適切な深さまで型に流し込みます。浸漬後、鉗子を使用してパラフィンから組織サンプルを取り出し、余分なパラフィンを取り除き、型に入れます。室温まで冷却してパラフィンを固化させ、パラフィンブロックを形成します。
   3. パラフィンミクロトームを使用して、埋め込まれたパラフィンブロックを厚さ5μmの切片に切断します。
4. スライスを取り付けたラット大腿骨標本をスライドウォーマーで1時間焼くと、スライスとカバーガラスとの接着性を高め、その後の染色プロセスでの浮きを減らします。
5. 焼きたてのスライスを純粋なキシレンに順番に浸してパラフィンを除去し、続いて無水エタノール、勾配エタノール(100%、95%、80%、70%)、および水による一連の脱水をそれぞれ2分間行い、脱パラフィンと再水和プロセスを完了します。
6. 脱パラフィン化したスライスをヘマトキシリン染色溶液に浸し、10分間染色します。流水ですすいで、結合していないヘマトキシリンを取り除きます。
7. ヘマトキシリン染色切片をエオシン染色溶液に浸し、2分間染色して細胞質と結合組織を着色します。1%酢酸溶液ですすいで、染色効果を固定します。
8. ラット大腿骨標本スライスを70%、80%、90%、95%、および100%エタノールに順次浸漬し、各勾配を2分間浸し、水分を徐々に除去します。
9. ラットの大腿骨標本スライスを純粋なキシレンに浸して透明にし、流水ですすいでキシレンを取り除きます。スライド部に中性樹脂を塗布し、スライド部を覆い、軽く叩いて気泡を取り除き、封入剤を固化させて埋込を完了させます。
10. Rのrandomizrパッケージを使用して、各グループに30枚のHE染色スライドを選択し、それぞれ15枚のスライドを2人の研究者に割り当てます。グループ分けを知らせずに、研究者にスライドの空裂率を計算してもらい、統計分析のために結果を収集します。

9. マイクロCT解析

1. モデリングが完了したら、ラットを安楽死させます。ヘマトキシリン-エオシン染色のために大腿骨を切除します。
2. ラットの大腿骨を4%パラホルムアルデヒドに24時間浸し、生体組織を標本として保存します。ラットの大腿骨を小動物専用のマイクロCT装置に入れます。
3. マイクロCTのスキャン条件を次のように設定します:X線電圧:80 kV、電流:100 μA、単一露光時間:50 ms、スキャン分解能:25 μm。0.5°の間隔でスキャンを行い、軟骨の下から骨端の上部までの海綿骨を対象領域として焦点を当てます。
4. ラットの大腿骨頸部の上の領域を関心領域として定義します。
5. マイクロCT装置を用いてスキャン結果の冠状面再構成を行い、マイクロCT装置の内蔵ソフトウェアによって生成された骨形態測定を収集します。次の観測された指標を記録します:総体積(TV)、骨体積の割合(BV / TV)、骨の表面/体積比(BS / BV)、構造の厚さ(Tb.Th)、構造分離(Tb.Sp)、骨の数(Tb.N)、骨密度(BD)。

10. 統計解析

1. データを平均±標準偏差 (SD) として表示します。マイクロCTおよび定量的組織学的評価のための統計解析を、独立サンプルのt検定を用いて実施します。0.05 < p 値を統計的に有意であると考えます。

結果

病理組織解析
ヘマトキシリンとエオシンの染色により、コントロール群とコントロール+負荷群では、骨柱帯が無傷で規則的に整列していることが明らかになりました。骨のくぼみには血管内皮細胞が存在し、細胞形態はふっくらと見えた。対照的に、モデルグループとモデル+荷重グループは、骨梁の骨折と乱れを示し、空の空孔の数が有意に多かっ?...

ディスカッション

現在、ウサギ²⁵、ラット²⁶、マウス²⁷、ブタ²⁸、ブロイ^ラー29、ダチョウ⁸、およびエ^ミュー30 などの種々の動物を用いて、大腿骨頭壊死のモデルを確立することができる。その中で、ラット、マウス、ウサギが最も一般的に使用される種です。?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
15ml centrifuge tube	Corning,USA	430791
5mm stainless steel bead	Gelisen,China	5mm
Acetic acid	Merck KGaA, Germany	64-19-7
Anhydrous alcohol	Merck KGaA, Germany	64-17-5
clay	Mincai stationery,China	102
Coverslip	Servicebio,China	WMWD-1818
Flat pressure bottle 10ml	BEHNCKE,China	MD10ml
Formic acid	Macklin Biochemical ,China	64-18-6
HE staining kit	Solarbio,China	G1120
HistoCore AUTOCUT	Leica, Germany	149AUTO00C1
Kinesio tape (elastic therapeutic tape)	Fuluo medicine,China	CL1819
Lipopolysaccharide	Solarbio,China	L8880
Lipopolysaccharides (LPS)	Selleck,USA	S7850
Manual carbon dioxide euthanasia box	Yuyan,China	LC-500-S1
Methylprednisolone sodium succinate,MPS	AbMole,China	M25573
MicroCT	Hiscan,China	Hiscan VM Pro
Neutral resin	Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology l ,China	ZLI-9555
Paraffin	Servicebio,China	WGHB-319213129
Paraformaldehyde	Servicebio,China	G1101-500ML
Potassium chloride	Macklin Biochemical ,China	7447-40-7
Slide	Servicebio,China	WG6012
Treadmill for Rats and  mice	Litc Life Science,USA	801
Xylene	Macklin Biochemical ,China	1330-20-7