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マウス海馬歯状回における顆粒細胞のin vivoカルシウムイメージング
要約
海馬の歯状回は、学習と記憶において重要で明確な機能を果たします。このプロトコルは、自由に動くマウスの歯状回における顆粒細胞の in vivo カルシウムイメージングのための一連の堅牢で効率的な手順を説明しています。
要約
学習と記憶の研究には通常、リアルタイムのアプローチが必要であり、 in vivo カルシウムイメージングは、行動課題中の覚醒動物のニューロン活動を調査する可能性を提供します。海馬はエピソード記憶や空間記憶と密接に関連しているため、この分野の研究において重要な脳領域となっています。近年の研究では、海馬CA1領域の神経活動を小型顕微鏡を用いて記録し、マウスを用いてオープンフィールドやリニアトラックなどの行動課題を行いながら、エングラム細胞や場所細胞を研究しています。歯状回は海馬のもう一つの重要な領域ですが、その深さが深く、イメージングが難しいため、 in vivo イメージングで研究されることはほとんどありませんでした。このプロトコルでは、ウイルスの注入方法、GRIN(Gradient-index)レンズの埋め込み方法、海馬の歯状回をイメージングするためのベースプレートの取り付け方法など、カルシウムイメージングプロセスを詳細に提示します。さらに、MATLAB を使用してカルシウムイメージング データを前処理する方法についても説明します。さらに、イメージングが必要な他の脳深部領域の研究も、この方法の恩恵を受ける可能性があります。
概要
これまでの研究では、海馬は記憶の処理や想起に不可欠な脳の構造であることがわかっています1,2。1950年代以降、げっ歯類の海馬の神経回路は、記憶の形成、保存、および検索の研究において焦点となってきました3。海馬内の解剖学的構造には、歯状回(DG)、CA1、CA2、CA3、CA4、およびsubiculum4の亜領域が含まれます。これらのサブリージョン間には複雑な双方向の接続が存在し、そのうちDG、CA1、およびCA3は、顆粒細胞と錐体細胞5からなる顕著な三シナプス回路を形成しています。この回路は、嗅内皮質(EC)から主要な入力を受け取り、シナプスの可塑性を研究するための古典的なモデルとなっています。海馬機能に関する以前のin vivo研究は、そのアクセスの容易さから、主にCA1 6,7に集中していました。CA1ニューロンは、記憶の形成、固定、および検索において重要な役割を果たしますが、特に空間記憶のための細胞では、海馬の他のサブ領域も重要です8,9
プロトコル
すべての動物手続きは、復旦大学の動物管理および使用委員会(202109004S)によって承認されました。この研究で使用されたすべての動物は、生後6か月のC57BL / 6Jでした。男女ともに使用しました。マウスを午前8時から午後8時まで12時間の光サイクルで飼育しました。脳表面からDG:A/P:-2.2mm、M/L:1.5mm、D/V:1.7mmの座標でウイルス注入を行いました。
1.歯状回へのウイルス注入
- 使い捨ての滅菌手袋やガウンなどの保護具を着用してください。
- 必要な手術器具、5 mL の生理食塩水 (0.9% NaCl [滅菌] または人工脳脊髄液) のチューブ 2 本、および 25 G ルアーロック鈍針 2 本を準備します。
注:すべての手術器具は、手術前に徹底的に滅菌する必要があります。高温(121-134°C)と高圧(20psi)でのオートクレーブを使用して、手術器具を滅菌しました。さらに、アルコールベースの消毒液を表面にスプレーしました。すべての外科的処置において、0.9%滅菌生理食塩水を使用しました。手術中に器具を加熱したガラスビーズで断続的に滅菌しました。 - ウイルスと接触する可能性のある消耗品を消毒するために、水に10%漂白剤溶液を準備します。
- 必要に応じて、滅菌した生理食塩水を使用してAAV-CaMKIIα-GCaMP6fウイルスを希釈....
代表的な結果
図1 は、ウイルス注入、GRINレンズ埋め込み、ベースプレート固定、ミニスコープによる in vivo カルシウムイメージング、データ処理などの実験手順の概略図を示しています。通常、全体の手続きには1か月かかります。 図2 は、頭蓋骨に開けられた穴の位置やGRINレンズ移植前の脳組織の状態など、ウイルス注入の手順の例を示しています。
ディスカッション
ここでは、マウスのDGにおける in vivo カルシウムイメージングの手順について説明しました。このプロトコルは、さまざまな認知プロセスにおけるDG機能の研究を目指す研究者、特に遺伝的に同定された亜集団が関心のある場合に有用であると考えています。ここでは、手術におけるいくつかの重要なポイントを強調しながら、私たちのプロトコルの利点を説明し、この方法の限界につ.......
開示事項
著者は、競合する金銭的利益を宣言しません。
謝辞
この研究は、復旦大学21TQ1400100(22TQ019)、上海市科学技術メジャープロジェクト、臨港研究所(助成金番号。LG-QS-202203-09)および中国国家自然科学基金会(32371036)。
....資料
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200 μL universal pipette tips | Transcat Pipettes | 1030-260-000-9 | For removing the blood and saline |
| 25 G luer lock blunt needle (Prebent dispensing tips) | iSmile | 20-0105 | For removing the brain tissue |
| 3D printed protective cap | N/A | N/A | To protect the GRIN Lens |
| 75% ethanol | Shanghai Hushi Laboratory Equipment Co.,Ltd | bwsj-230219105303 | For disinfection and cleaning the GRIN lens surface |
| AAV2/9-CaMKIIα-GCaMP6f virus | Brain Case | BC-0083 | For viral injection |
| Adobe Illustrator | Adobe | cc 2018 version 22.1 | To draw figures |
| Anesthesia air pump | RWD Life Science Co.,Ltd | R510-30 | For anesthesia |
| Camera control software | Daheng Imaging | Galaxy Windows SDK_CN (V2) | For recording the behavioral data |
| Cannula/Ceramic Ferrule Holders (GRIN lens holder) | RWD Life Science Co.,Ltd | 68214 | To hold the GRIN lens |
| Carprofen | MedChemExpress | 53716-49-7 | To reduce postoperative pain of the mouse |
| Coax Cable | Open ephys | CW8251 | To connect the miniscope and the miniscope DAQ box |
| Confocal microscope | Olympus Life Science | FV3000 | For observing the brain slices |
| Cotton swab | Nanchang Xiangyi Medical Devices Co.,Ltd | 20202140438 | For disinfection |
| Customized headplate | N/A | N/A | For holding the mouse on the running wheel |
| Customized headplate holder | N/A | N/A | To hold the headplate of the mouse |
| Denture base matierlals (self-curing) | New Centry Dental | 430205 | For attaching the miniscope |
| Depilatory cream | Veet | ASIN : B001DUUPQ0 | For removing the hair of the mouse |
| Desktop digital stereotaxic in strument, SGL M | RWD Life Science Co.,Ltd | 68803 | For viral injection and GRIN lens implantation |
| Dexamethasone | Huachu Co., Ltd. | N/A | To prevent postoperative inflammation of the mouse |
| Dissecting microscope | RWD Life Science Co., Ltd | MZ62-WX | For observing the conditions during surgeries |
| Gas filter canister, large, packge of 6 | RWD Life Science Co.,Ltd | R510-31-6 | For anesthesia |
| GRIN lens | GoFoton | CLHS100GFT003 | For GRIN lens implantation |
| GRIN lens | InFocus Grin Corp | SIH-100-043-550-0D0-NC | For GRIN lens implantation |
| Induction chamber-mouse (15 cm x 10 cm x 10 cm) | RWD Life Science Co.,Ltd | V100 | For anesthesia |
| Industrial camera | Daheng Imaging | MER-231-41U3M-L, VS-0618H1 | For acquiring the behavioral data |
| Iodophor disinfectant | Qingdao Hainuo Innovi Disinfection Technology Co.,Ltd | 8861F6DFC92A | For disinfection |
| Isoflurane | RWD Life Science Co.,Ltd | R510-22-10 | For anesthesia |
| Liquid sample collection tube (Glass Capillaries micropipette for Nanoject III) | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | For viral injection |
| MATLAB | MathWorks | R2021b | For analyzing the data |
| Microdrill | RWD Life Science Co.,Ltd | 78001 | For craniotomy |
| Micropipette puller | Narishige International USA | PC-100 | For pulling the liquid sample collection tube |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | For viral injection |
| Miniscope DAQ Software | Github (Aharoni-Lab/Miniscope-DAQ-QT-Software) | N/A | For recording the calcium imaging data |
| Miniscope Data Acquisition (DAQ) Box (V3.3) | Open ephys | V3.3 | To acquire the calcium imaging data |
| Miniscope V4 | Open ephys | V4 | For in vivo calcium imaging |
| Miniscope V4 base plate (Variant 2) | Open ephys | Variant 2 | For holding the miniscope |
| nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company | 3-000-207 | For viral injection |
| Ophthalmic ointment | Cisen Pharmaceutical Co.,Ltd. | H37022025 | To keep the eyes moist |
| PCR tube | LabServ | 309101009 | For dilue the virus |
| Personal Computer (ThinkPad) | Lenovo | 20W0-005UCD | To record the calcium imaging data and behavioral data |
| Running wheel | Shanghai Edai Pet Products Co.,Ltd | NA-H115 | For holding the mouse when affixing the base plate |
| Screwdriver (M1.6 screws) | Greenery (Yantai Greenery Tools Co.,Ltd) | 60902 | To unscrew the M1.6 screws |
| Screwdriver (set screws) | Greenery (Yantai Greenery Tools Co.,Ltd) | S2 | For unscrew the set screws |
| Set screw | TBD | 2-56 cone point set screw | For fasten the miniscope to its base plate |
| Small animal anesthesia machine | RWD Life Science Co.,Ltd | R500 | For anesthesia |
| Sterile syringe | Jiangsu Great Wall Medical Equipment Co., LTD | 20163140236 | For rinse the blood |
| Surgical scissors | RWD Life Science Co.,Ltd | S14016-13 | For cutting off the hair and scalp |
| ThermoStar temperature controller,69025 pad incl. | RWD Life Science Co.,Ltd | 69027 | To maintain the animal's body temperature |
| Ultra fine forceps | RWD Life Science Co.,Ltd | F11020-11 | For removing the bone debris and dura |
| USB 3.0 cable | Open ephys | N/A | To connect the miniscope DAQ box and the computer |
| UV light | Jinshida | 66105854002 | To fix the GRIN lens on the skull |
| UV resin (light cure adhesive) | Loctite | 32268 | To fix the GRIN lens on the skull |
| Vacuum pump | Kylin-Bell | GL-802B | To remove the blood, saline and the brain tissue |
参考文献
- Scoville, W. B., Milner, B. Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 20 (1), 11-21 (1957).
- Spiers, H. J., Burgess, N., Hartley, T., Vargha-Khadem, F., O'keefe, J.
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