α-Synuclein凝集体の鼻腔内投与技術

要約

本プロトコルは、α−シヌクレイン凝集体の鼻腔内投与の方法を記載している。この手法は、パーキンソン病における嗅粘膜から嗅球へのα-シヌクレインの伝播に関する知見を提供します。

要約

パーキンソン病(PD)は、α-シヌクレイン(α-Syn)の凝集体であるレビー小体の存在を特徴とする神経変性疾患です。最近、この疾患は、迷走神経の嗅球(OB)または背側核からのα-Syn凝集体のプリオン様伝播を通じて発症および進行することが提案されました。OBにおけるα-Syn凝集体の起源は不明ですが、近年、嗅粘膜からの伝播が示唆されています。私たちは以前、マウスモデルでα-Syn凝集体を鼻腔内に投与すると、マウスのOBにα-Synの病理が誘発されることを示しました。本研究では、マウスのOBにα-Synの病理を誘発したα-Syn凝集体の鼻腔内投与の方法を提示する。α-Syn凝集体の鼻腔内投与は非常に簡便で分かりやすい方法であり、産婦人科におけるα-Synの病理の起源や嗅覚系を通じたα-Synの伝播経路を解明する研究に役立つツールになると考えています。

概要

パーキンソン病(PD)は、運動緩慢、安静時振戦、筋肉のこわばりなどの運動症状を呈し、神経変性疾患の中で2番目に多い疾患^です1。PDは、嗅覚機能障害、認知障害、うつ病、幻覚、便秘、起立性低血圧などの非運動症状も示します。その病理学的特徴は、黒質におけるドーパミン作動性細胞死と、レビー小体²と呼ばれるα-シヌクレイン(α-Syn)凝集体の存在です。

注目すべきは、α-Synは、通常の条件下で可溶性モノマー(または四量体)の形で存在する140アミノ酸のタンパク質です。しかし、異常な条件下では、可溶性モノマーはオリゴマーやフィブリルなどの不溶性の高分子量凝集体に変換されます。α-Synのオリゴマーおよびフィブリルへの移行は、細胞毒性に関与していると報告されています³。

最近の研究では、ニューロン間でのα-Syn凝集体のプリオン様伝播が示唆されています。数多くの死後検査に基づいて、Braakらは2003年に、レビー小体の病理がやや常同的な方法で脳内で徐々に広がるという仮説(Braakの仮説)^を提唱しました^4,5。2008年、胎児中脳移植を受けたパーキンソン病患者の死後検査により、胎児組織に由来するドーパミン作動性ニューロンにレビー小体が明らかになった^6,7。これらの研究は、α-Syn凝集体が罹患した脳から移植片に広がる可能性があることを示唆しており、Braakの仮説を裏付けています。

これらの観察結果に続いて、初代ニューロン培養とマウスでのα-Syn凝集体の脳内注射を含む実験により、レビー小体様凝集体の広がりが再現され、プリオン様の方法でα-Synが伝播するさらなる証拠が得られました^8,9。

Braakらは、PDのレビー小体病理が嗅球(OB)および/または迷走神経の背側核(dmX^)で開始されることを示しました4。Braakの仮説に基づき、いくつかの研究で、PD脳からのα-Syn凝集体またはレビー小体抽出物を実験動物のOBおよび消化管に投与したことが報告されている10,11,12。2018年に行われた研究では、野生型マウスのOBにα-Syn凝集体を投与すると、嗅覚経路に沿ってα-Synの病理が伝播し、嗅覚機能障害が生じることが実証されました¹³。我々は以前に、α-Syn凝集体をα-SynトランスジェニックマウスのOBに接種し、これが海馬の萎縮と記憶障害につながることを見出した¹⁴。

2022年には、ヒト以外の小型霊長類であるマーモセットのOBにα-Syn凝集体を接種しました。その結果、嗅覚経路に沿ったα-Syn病理の伝播、OBの萎縮、および広範な脳グルコース代謝低下がもたらされました¹⁰。

しかし、α-Syn凝集体の伝播がOBから発生する場合、α-Syn凝集体が最初に現れるのはどのメカニズムによるのかという重大な疑問が生じます。Saitoらは以前に、鼻粘膜にレビー小体が存在することを報告した¹⁵。α-Syn凝集体の存在は、リアルタイム震え誘発変換(RT-QUIC)分析¹⁶を使用して、PDおよび多系統萎縮症(MSA)患者の鼻粘膜で検出されました。特に、PDの前駆期と考えられている急速眼球運動睡眠行動障害(RBD)患者の鼻粘膜サンプルを分析したところ、α-Synレベルの増加が明らかになりました¹⁷。この研究は、α-Synの病理がPDの前駆期からでも鼻粘膜に存在する可能性があることを示唆しました。

これらの知見は、鼻粘膜から産婦人科への経路の可能性を示唆しているが、このシナリオを裏付ける実験的証拠は限られている。このギャップを埋めるために、マウスの鼻腔内にα-Syn凝集体を投与し、鼻粘膜から産婦人科へのα-Syn病理の伝播を調査しました。私たちの実験的アプローチは、野生型マウスのα-Syn凝集体の単回鼻腔内投与がOBにα-Synの病状を誘発することを示し、鼻粘膜からOBへの伝播経路の実験的証拠を提供しました。

プロトコル

この研究では、生後2か月のC57BL/6J雄マウスを使用しました。すべての実験手順は、国のガイドラインに従って実施されました。京都大学動物実験委員会より、本研究について倫理的な承認と許可が下りました（MedKyo 23,544名〉。

1. α-Synプリフォームドブリルの鼻腔内投与

1. 以前に報告された方法に従って、PBS(4 mg / mL)中のマウスα-Synフィブリル溶液を調製します¹¹。チューブを透明フィルムで包み、汚染を防ぎます。
2. 200 μLのα-Synフィブリル溶液を超音波処理し、ウォーターバス型ソニケーターを使用してα-Synプレフォームフィブリル(PFF)を生成します(材料表)。超音波浴に水を入れ、角氷を加えて4°Cまで冷まして超音波処理します。各サイクルは30秒の超音波処理とそれに続く30秒の間隔(合計5サイクル)からなる合計5分間、フィブリルを超音波処理します。
   注意: α-Synの曝露を防ぐために、使い捨て手袋、マスク、安全ゴーグルなどの個人用保護具を使用してください。
3. 10 μLのピペットチップを備えたP10ピペット(Table of Materials)を準備します。塩酸メデトミジン、ミダゾラム、およびブトルファノール (MMB) の組み合わせを使用して、腹腔内 (i.p.) 注射により各マウスに麻酔をかけます。MMB配合麻酔薬には、ミダゾラム(0.3 mg / kg)、メデトミジン(4 mg / kg)、酒石酸ブトルファノール(5 mg / kg)が含まれていました。ミダゾラム(1 mg/mL)0.3 mL、メデトミジン(5 mg/mL)0.8 mL、酒石酸ブトルファノール(5 mg/mL)1 mL、生理食塩水2.9 mLを混合する場合は、0.005 mL/gをi.p.注射で使用します。
4. マウスが完全に麻酔されたことを確認するために10分待ちます。適切な麻酔は、マウスが横臥位にあり、自分自身を元に戻すことができない場合を確認できます。麻酔をかけたら、目の乾燥を防ぐために滅菌綿のアプリケーターを使用して眼科用軟膏を塗布します。
   注:麻酔なしでは、経鼻投与を行うと、マウスを仰臥位に保ち、マウスがくしゃみをするときにα-Syn溶液を適切に投与することは困難です。.これらの理由から、鎮静剤が必要でした。
5. 麻酔をかけたマウスを仰臥位に置きます。ペーパータオルまたは同様の素材を体の下に置き、頭を少し下に傾けるようにします(図1A、B)。この配置により、投与されたα-Syn溶液が肺や食道に急速に流れ込むのを防ぎ、鼻腔内での滞留を促進します。鼻孔を 図1Cに示します。
6. 1 μL の α-Syn 溶液 (4 mg/mL) を P10 ピペットに取り込み、ピペットの先端をマウスの鼻の近くに置きます。ゆっくりと丸い液滴を形成し、ピペットチップの端に保ちます(図1D、赤い矢印)。鼻腔内投与は片側鼻孔に対して行われ、対側をコントロール側として使用します。
7. ドロップをマウスの鼻孔の片側に近づけ、マウスが自然に吸い込むのを待ちます。吸入を観察し、30秒から1分待ちます(図1E)。
8. 手順1.6.-1.7を繰り返します。総容量20μLのα-Syn溶液を投与するまで。すべての手順の後、手袋を廃棄し、表面がα-Synで汚染されている場合は、ベンチを市販の洗剤で拭いてください
   注:手順を実行する人員によるα-Synフィブリルの吸入を防ぐために、すべての手順を安全キャビネットで実行する必要があります。.以前の報告では、25μLの容量が鼻から脳への薬物投与に最も効率的であることが示されています¹⁸。本研究では、同様の容量の20μLを使用します。また、前報告¹⁰のOBへの注入用と同じ濃度のPFFを使用しており、これはPFFの400μM(5.6mg/mL)に近い¹⁹。
9. アチパメゾール(3 mg / kg; 資料表)I.P.注射により、メデトミジンを逆転させ、回復を促進します。アチパメゾール(5 mg / mL)0.6 mLと生理食塩水4.4 mLを混合する場合は、i.p.注射で0.005 mL / gを使用します。.
   注:α-Synの鼻腔内投与がどれほどストレスになるかは完全には理解されていないため、鎮痛を提供します。.
10. マウスが胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、マウスを放置しないでください。完全に回復したら、マウスをケージに戻します。

2. サンプル調製

1. α-Synプリフォームドブリルの鼻腔内投与後1、3、6、および12か月で、治療したマウスを犠牲にします。.
   1. マウスを誘導ボックスに入れ、セボフルラン(>6.5%)を投与し、>60秒間呼吸停止が発生するまで続けます。マウスを取り外し、安楽死を確実にするために右心房切開による迅速な放血を行います。
2. 25Gの針(材料表)を心臓の頂点に挿入します。マウスを4 mL/分で灌流し、15 mLのPBS溶液に4% PFAを注入します。
3. ハサミで頭を切り落とし、メスで頭皮に2cmの切開をします。頭蓋骨を下から鼻にかけて外側のハサミで切開します(図2A、B)。OBを取得するには、OBの頭蓋骨を完全に取り除きます(図2B、黄色の円)。
4. 頭をひっくり返し、脳神経を切断してから、鉗子で脳を慎重に取り除きます(図2C、D)。OBが無傷の脳を取得します(図2E)。無傷のOBを得るには、OBが頭蓋骨に付着するように鉗子で嗅神経を慎重に切断します(図2D、黄色の円)。
5. 脳サンプルをPBS中の4%PFAに4°Cで一晩入れます。 脳サンプルを24時間以上放置しないでください。
   注:過度の固定は免疫組織化学染色を減少させます。長期保存が必要な場合は、脳サンプルを70%エタノールまたは0.1%アジ化ナトリウムを含むPBSで保存して、無菌性を維持します。

3. OBの免疫組織化学的染色

1. 以下に説明するように、自動ティッシュプロセッサー(Table of Materials)を使用してサンプルをパラフィンします。
   1. 70%エタノールに120分間浸漬し、続いて100%エタノールに8回60分間浸漬します。次に、100%キシレンに3回、120分間浸します。
   2. パラフィンを60°Cで120分間浸漬した後、60°Cのパラフィンに240分間浸漬します。
2. 以下に説明するように、サンプルをパラフィンに埋め込みます。
   1. モジュール式組織包埋センターを使用して、サンプルを60°Cのパラフィンに埋め込みます(材料表)。氷の上で冷やします。
3. サンプルをミクロトーム(材料表)¹⁸で厚さ8μmに切断します。
4. 以下に説明するように脱パラフィン化を行います。
   1. 100%キシレンに2回5分間浸漬し、続いて100%エタノールに2回3分間浸漬します。
   2. 70%エタノールに3分間浸漬します。PBSで3分間洗浄します。
5. 以下に説明するように抗原賦活化を行います。
   1. 100%ギ酸に15分間浸します。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2分間すすぎます。
   2. オートクレーブを120°Cで10分間加熱します。自然に冷まします。
6. 1%過酸化水素をメタノールに10分間浸漬します。PBSで5分間洗浄します。
7. スライド上にPBS中の500 μLの5%スキムミルクを加え、室温で30分間インキュベートします。
8. 500 μLの抗リン酸化α-Syn抗体(p-α-Syn、1/10000)をPBSに入れ、スライド上に置き、4°Cで一晩インキュベートします。 PBSで2回、各5分間洗浄します。
9. ユニバーサル免疫ペルオキシダーゼポリマー、抗ウサギ(材料表)と25°Cで1時間インキュベートします。 PBSで2回、各5分間洗浄します。
10. 3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)染色キット(材料表)を使用して、製造元の指示に従って5分間現像します。
11. ヘマトキシリン溶液に1分間浸漬します(材料の表)。流水で10分間脱色します。
12. 以下の説明に従って取り付けを行ってください。
    1. 70%エタノールに5分間浸漬します。100%エタノールに2回、5分間浸漬します。
    2. キシレン100%に2回、5分間浸漬します。埋め込み媒体(材料表)を使用して取り付けます。100 μLの埋め込み用メディウムをスライドに塗布し、ガラスカバースリップで覆います。
13. All-in-One顕微鏡を使用して、倍率20倍および40倍で画像を取得します(材料表)。

結果

図 3 に、OB の α-Syn アグリゲートの例をいくつか示します。本研究では、α-Syn凝集体を片側性鼻孔に投与しました。2つの鼻腔は鼻中隔によって分離されており、各OBは嗅覚ニューロンを各鼻腔に別々に投影します。そのため、対側のOBをコントロールとして使用することができます。

P-α-Synの病理は、1ヵ月後および3ヵ月後?...

ディスカッション

以前の研究では、マカクザルの鼻腔へのα-Syn凝集体の投与は、ドーパミン作動性細胞の死と黒質への鉄沈着を誘発したが、α-Syn凝集体は観察されなかった²¹。プリオンプロモーター α-Synトランスジェニックマウス(M83マウス)の鼻腔内にA53Tヒトα-Syn凝集体を毎日28日間投与すると、脳にα-Synの病理が誘発され、マウスの運動症状が誘発されることが報?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
All-in-One Fluorescence Microscope BZ-X710	KEYENCE	N/A	All-in-One microscope
Ampicillin Sodium Salt	Nacalai tesque	02739-32
Bioruptor II	Sonicbio	BR2006A	Water bath type sonicator.
Butorphanol tartrate	Meiji Seika Pharma	WAK-52850
Cellulose tube	MISUMI	UC20-32-100
DeepWellMaximizer	TAITEC	MBR-022UP	Shaker
DynaCompetent Cells Zip BL21(DE3)	BioDynamics Laboratory Inc.	DS255	Competent cell
Entellan	Sigma-Aldrich	107961	Rapid mounting medium for microscopy
Graefe Extra Fine Forceps Curved Serrated	FST	11152-10	forceps
Hardened Fine Scissors	FST	14090-09	scissors
Histofine Simple stain mouse MAX-PO (R)	Nichirei Bioscience	414341	Universal Immuno-peroxidase Polymer, anti-Rabbit
ImageJ ver 1.52p	NA	NA	https://imagej.net/
innova4200	New Brunswick scientific	9105085	Incubator shaker
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside	Nacalai tesque	19742-94
LB broth, Lennox	Nacalai tesque	20066-24
Leica EG 1150 H	Leica	14 0388 86 108	Modular Tissue Embedding Center
Leica TP 1020	Leica	14 0422 85108	Automatic Tissue Processor
Medetomidine	Fuji Film	135-17473
Microm HM325 Rotary Microtome	Thermo Scientific	902100
Midazolam	Maruishi Seiyaku	4987-211-76210-0
New hematoxylin Type G	Muto	65-9197-38	Hematoxylin solution
Normal winged needle for vein D type, 25G	TERUMO	NN2332R	25G needle
Optima TLX Ultracentrifuge	Beckman Couler	8043-30-1197	Ultracentrifuge
P10 pipette	Gilson	FA10002P
Paraffin	Leica	39601095
paraformaldehyde	Nacalai tesque	30525-89-4
Peroxidase Stain DAB Kit	Nacalai tesque	25985-50
Pirece BCA Protein Assay Kits	Thermo Scientific	23225	BCA assay
pRK172	Addgene	#134504	Plasmid
Q-Sepharose Fast Flow.	cytiva	17051001	Ion exchange resin