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要約

この記事では、わさびによって引き起こされる刺痛感に対するアルコール飲料の嗅ぎ分けの抑制能力を測定するための一連の方法について説明します。

要約

食品の調理に一般的に使用される市販のわさびペーストには、消費時に刺激的な感覚を引き起こす化学感覚イソチオシアネート(ITC)の相同化合物が含まれています。食事のアルコール飲料を嗅ぐことがわさびの辛さの感覚に与える影響は研究されていません。ほとんどの官能評価研究は個々の食品と飲料に別々に焦点を当てていますが、わさびを飲みながら酒を嗅ぐ嗅覚研究に関する研究は不足しています。ここでは、動物行動学と畳み込みニューラルネットワークを組み合わせて、マウスが酒を嗅ぎながらわさびを摂取するときの表情を解析する方法論を開発しました。この結果は、学習済みで検証済みの深層学習モデルが、ワサビ陰性酒陽性グループのクラスに属するワサビとアルコールの共治療を描いた画像の29%を認識し、事前の学習教材のフィルタリングを必要とせずに認識することを示しています。選択したビデオフレーム画像から得られたマウスのしかめっ面スケールスコアの統計解析により、酒の有無との間に有意差(P < 0.01)が明らかになりました。この知見は、マウスのワサビ誘発反応に対して、食事性アルコール飲料が減少効果を有する可能性を示唆している。この組み合わせ方法論は、将来、個々のITC化合物のスクリーニングやスピリット成分の官能分析に可能性を秘めています。しかし、アルコールによるわさび辛味の抑制の根本的なメカニズムを調査するには、さらなる研究が必要です。

概要

一般にわさびとして知られているワサビジャポニカは、食品調理で認知されています1,2。涙を流したり、くしゃみをしたり、咳をしたりすることを特徴とする、消費時に引き起こされる強烈な感覚体験はよく知られています。わさびのこの独特の辛味は、化学感覚イソチオシアネート(ITC)の相同化合物に起因する可能性があります。それらは揮発性有機硫黄植物化学物質であり、ω-アルケニルとω-メチルチオアルキルイソチオシアネート3に分類できます。これらの化合物の中で、アリルイソチオシアネート(AITC)は、西洋わさびやマスタード4などのアブラナ科に属する植物に最も多く見られる天然ITC製品です。市販のわさびペーストは一般的に西洋わさびから調製されるため、AITCはこれらの市販製品の品質管理に使用される化学マーカーとなっています5。

食事性アルコール飲料とわさびを注入した料理を組み合わせることは、文化的気質の一例と見なすことができます6。主観的には、この組み合わせはわさびとスピリッツの間の辛さと熱さを補完し、全体的な料理体験を向上させる可能性があります。動物定性的行動評価(QBA)は、短期または長期の外部刺激に対する被験者の行動変化を数値7を用いて調べる、包括的な全動物的方法論的アプローチである。この方法には、疼痛テスト、運動テスト、学習および記憶テスト、およびげっ歯類モデル8用に特別に設計された感情テストが含まれます。しかし、味覚と嗅覚の相乗的官能評価を調査した研究は、これまで文献に乏しいままです9,10。化学感覚に関する研究のほとんどは、個々の食品と飲料の消費を別々に調べることに限定されています11。そのため、わさびを飲みながら酒の匂いを嗅ぐ行為を含む味覚と匂いの相互作用に関する研究は不足しています。

わさびによる刺痛感覚は侵害受容の一種であると考えられているため12、動物の行動評価は、げっ歯類の動物における侵害受容性感覚反応の評価によく適している8,13,14。マウスの侵害受容を評価するための方法は、マウスしかめっ面スケール(MGS)スコアリングとして知られている、Langfordらによって開発されました15,16。この行動研究法は、実験マウスが示した表情の解析に依存した、痛みに関連する評価アプローチです。実験のセットアップは簡単で、透明なケージとビデオ録画用の2台のカメラを使用します。自動データ収集のための先進技術17、18、19を組み込むことにより、定量的および定性的な行動測定を得ることができ、行動モニタリング20における動物福祉を向上させることができる。したがって、MGSは、動物に対するさまざまな外部刺激の影響を中断することなく自由に研究する際に適用できる可能性を秘めています。ただし、採点プロセスでは、パネリストによる評価のために数枚(10枚未満)のビデオフレーム画像を選択するだけであり、事前のトレーニングが必要です。大量のサンプル画像のスコアリングは、手間がかかる場合があります。この時間のかかる課題を克服するために、いくつかの研究では、MGSスコア21,22を予測するために機械学習技術が採用されています。ただし、MGSは継続的な尺度であることに注意することが重要です。したがって、マルチクラス分類モデルは、わさびを摂取し、酒の匂いを嗅ぐマウスの画像が正常なマウスの画像に似ているかどうかを判断するなど、論理的およびカテゴリー的な問題を評価するためにより適しています。

本研究では、マウスにおける味覚と匂いの相互作用を調査するための方法論を提案した。この方法論は、動物の行動研究と畳み込みニューラルネットワーク(CNN)を組み合わせて、マウス被験者の顔の表情を分析します。2匹のマウスは、通常の行動条件下で、ワサビ誘発性侵害受容の経験中、および特別に設計されたケージ内で酒を嗅いでいるときに3回観察されました。マウスの表情を動画に記録し、生成されたフレーム画像を活用して深層学習(DL)モデルのアーキテクチャを最適化しました。その後、独立した画像データセットを使用してモデルを検証し、実験グループから取得した画像を分類するためにデプロイしました。わさびの摂取中にマウスが同時に酒の匂いを嗅いだ場合のわさび辛味の抑制の程度を決定するために、人工知能によって提供される洞察は、別のデータ分析方法であるMGSスコア16との交差検証を通じてさらに裏付けられました。

プロトコル

本研究では、体重17-25gの7週齢ICR雄マウス2匹を動物行動評価に利用した。すべての住居と実験手順は、教育と研究における人間と動物の被験者の使用に関する香港バプテスト大学委員会によって承認されました。動物の部屋は、12時間の明暗サイクルで25°Cの温度と40%〜70%の部屋の湿度に維持されました。

1.ケージの設計

  1. ケージ構造用の3つの異なる寸法のアクリロニトリルブタジエンスチレンレンガを準備します:8 mm x 8 mm x 2 mm、16 mm x 16 mm x 6 mm、および32 mm x 16 mm x 6 mm。
  2. ケージベースとしてアクリロニトリルブタジエンスチレンプレート(312 mm x 147 mm x 2 mm)を準備します。
  3. 底板として使用する厚さ2mmの239mm×107mmの不透明アクリル板を用意します。
  4. 天板として使用する厚さ5mmの239mm×107mmの透明アクリル板を用意します。
  5. 端子板として使用する厚さ7mmの107mm×50mmの透明アクリル板を用意します。
  6. レンガを54mmの高さに積み重ねて、2つの不透明な側壁を構築します。
  7. アクリル板をアクリロニトリルブタジエンスチレンベースのケージに埋め込みます( 図1Aに示すように)。
  8. 図1Bに示すように、厚さ2mmの90mm×50mmの透明アクリル板5枚で構成されたチャウズチャンバーを準備します。透明アクリル板5枚のうち、側面に2枚、上部に1枚、下部に1枚、端子に1枚のプレートを使用します。
  9. チャウ導入プレートとして60mm×50mm×2mmの透明アクリルプレートを用意し、チャウの部屋に置きます。

2.動物行動評価

  1. 7週齢のICRオスマウス2匹の同腹仔を通常のケージに一緒に入れます。
  2. 2匹のマウスの同腹仔に、1週間の適応期間中、餌のペレットと水道水への無料アクセスを提供します。
  3. 1週間後、2匹のマウスの同腹仔をエタノールのボトル(~40% v/v)で導入します。
    注:飲酒が制限されている間、提供された水性エタノールを 自由 自在に嗅いだり吸い込んだりすることが許可されていることを確認してください。
  4. 9〜10週齢のマウスモデルと 、図1Aに示されている透明なキュービクルケージを使用して行動実験を行います。
  5. アクリル板とアクリロニトリルブタジエンスチレン板を全て分解し、よく清掃してください。まず、超純水で3回以上すすぎ、ペーパータオルで乾かします。次に、75%エタノールをスプレーし、レンズペーパーで洗浄します。最後に、少なくとも15分間風乾させます。
  6. 行動実験の各再現前に、マウスの体重を量り、体重を記録します。
  7. わさびとピーナッツバターの混合物を、市販のわさび1gとピーナッツバター4.5gの重さで新たに調製します。ジッパー付きのビニール袋に混ぜます。
    注:わさび中のイソチオシアネートは揮発性があるため、市販のわさびは-20°Cの冷凍庫で保存することが重要です。
  8. 図1B、Cに示すように、0.5gのピーナッツバターペースト2個、またはわさびとピーナッツバターの混合物をチャウ導入プレートに秤量し、提供します。
  9. 図1B、Cに示すように、準備したチャウ導入プレートをチャウの部屋に置き、各ビデオ録画セッション中に2匹のマウスが自由に餌にアクセスできるようにします。
  10. 図 1B、C に示すように、純水または酒 (~42% v/v エタノール) のいずれかの 30 mL の液体で下の溝を満たし、同時吸入を容易にします。
  11. 各端末の電話スタンドに設置された2台のスマートフォンのカメラを使用して録画を開始します。
    注:ビデオの仕様は次のとおりです:フレーム幅、1920年。フレームの高さ、1080;データレート、20745 kbps;フレームレート、30.00フレーム/秒(fps)。
  12. 訓練された2匹の同腹仔マウスを、設計された動物行動研究プラットフォームに上から慎重に配置し、ケージをトッププレートで迅速に固定します。
    注: この手順が 15 秒以内に完了していることを確認してください。
  13. 各ビデオを2〜3分間録画します。
    注:ピーナッツバターとわさびの混合物の調製からビデオ録画の完了まで、実験の全期間が5分に制限されていることを確認してください。
  14. 実験全体を3回繰り返します。
    注:実験の各反復が少なくとも6時間離れていることを確認してください。
  15. さまざまなシナリオを模倣します。
    注:たとえば、この研究では、マウスのペアを4つのグループで使用し、上記の実験設定を使用して模倣した4つの異なるシナリオを使用しました。これらのシナリオには、バックグラウンド研究のシナリオ A、ポジティブ コントロール研究のシナリオ B、ワサビ-アルコール 味-匂いの相互作用研究のシナリオ C、ネガティブ コントロール研究のシナリオ D が含まれます。 表 1 に、これらのシナリオの概要を示します。

3. 画像認識

画像処理に関する多くの研究23,24,25と同様に、分類モデルはCNNの訓練によって達成された。DL 操作のスクリプトは、Jupyter Notebook (anaconda3) 上の Python v.3.10 で記述されました。これは、次のGitHubリポジトリで入手できます:git@github.com:TommyNHL/imageRecognitionJove.git。CNN の構築とトレーニングには、numpy v.1.21.5、seaborn v.0.11.2、matplotlib v.3.5.2、cv2 v.4.6.0、sklearn v.1.0.2、tensorflow v.2.11.0、keras v.2.11.0 などのオープンソース ライブラリが使用されました。これらのライブラリは、画像認識のためのCNNを開発およびトレーニングするために必要なツールと機能を提供しました。

  1. 収集したビデオ クリップから一連のビデオ フレーム イメージをエクスポートし、提供されている Jupyter Notebook ( Step1_ExtractingAndSavingVideoFrameImages.ipynb) を使用してモデル トレーニング用のデータ セットを生成します。
  2. 提供されたペーストを消費するマウスが少なくとも1つある画像のみを選択します。選択された画像の例を 、補足図1、補足図2、補足図3、補足図4、補足図5、補足図6、 および 補足図7に示します。
  3. Jupyter Notebook で提供されているスクリプト Step2_DataAugmentation.ipynb を実装して、生成された画像を水平方向に反転することでデータ拡張を実行します。
  4. 1 秒ごとにレプリケートするイメージ データを、外部の独立した CNN モデルの検証用に予約します。各 1 回目と 3 回目の反復の画像を使用して、内部モデルのトレーニングとテストを行います。
  5. CNN モデリングで使用される画像データを前処理するには、Jupyter Notebook で Step3_CNNmodeling_TrainTest.ipynb という名前のスクリプト (画像のサイズ変更、黒色変換、画像信号の正規化など) を実行します。
  6. トレーニング資料を内部トレーニングデータセットとテストデータセットに 8:2 の方法でランダムに分割します。
  7. CNN のアーキテクチャを初期化します。調査するシナリオの数に基づいて、CNN の出力数を設計します。
    注:たとえば、この研究では、ニューラルネットワークが3つのクラスを分類するように指定されました。クラスの重みに関するデータの不均衡を処理するスクリプトがコンパイルされていることを確認します。
  8. CNN 構築の内部テスト サンプルで損失が最小になるハイパーパラメーターの組み合わせを見つけます。
  9. CNN アーキテクチャの構築に最適なハイパーパラメーターの組み合わせを採用します。
  10. 提供されている Jupyter Notebook Step4_CNNmodel_ExternalValOriginal.ipynb と Step5_CNNmodel_ExternalValFlipped.ipynb を開きます。動物行動実験の2回目の複製からの独立した(元の画像と反転した)画像を使用して、達成されたモデルを検証します。
  11. Jupyter Notebook Step6_CNNmodel_Application.ipynb を使用して、実験グループから生成されたビデオ フレーム画像を分類するための、達成され検証されたモデルをデプロイします。
    注:たとえば、この作品のシナリオCです。

4.手動マウスしかめっ面スケールスコアリング

注:CNNモデル予測によって提供される洞察を検証するために、以前にLangfordらによって開発および検証された別の方法が適用されました16。この方法では、5つの特定のマウスフェイシャルアクションユニット(AU)に基づいてMGSをスコアリングします:眼窩の引き締め、鼻の膨らみ、頬の膨らみ、耳の外側への引き締め、ひげの変化。各AUには、AUの不在、中程度の存在、または明らかな存在を示す0、1、または2のスコアが割り当てられます。このスコアリングシステムにより、各AUの定量化とスケーリングが可能になり、マウスが経験した侵害受容または不快感のレベルを評価できます。

  1. 各ビデオクリップのペーストを摂取している同腹仔の3つのビデオフレーム画像をキャプチャします。各フレームが 3 秒以上離れていることを確認してください。
  2. "shuffleSlides.pptm" という名前の提供されたテンプレート ファイル (補足ファイル 1) を使用し、埋め込まれたマクロ コードを実行することにより、ブラインド コードを作成し、さまざまなシナリオ クラスの画像を順番にランダムに並べ替えます。
  3. 少なくとも 10 人のパネリストを招待して、サンプル画像を採点してもらいます。
  4. MGS を使用して画像サンプルをスコアリングするようにパネリストをトレーニングします。パネリストに、MGSに関する元の記事とそのマニュアル15,16を含むトレーニング資料を提供します。
  5. キャプチャされたフレーム内の各動物の被験者のMGSスコアを、対応する5つの顔のAUのすべてのスコアポイントを平均して計算します。MGS スコアを平均±標準測定誤差 (SEM) として表示します。
  6. 異なるシナリオのクラス間で統計的に有意な差が存在するかどうかを、Bonferroniの多重比較の事後検定による一元配置分散分析(ANOVA)により判断します。
    注: P < 0.05 の値は、統計的に有意であると見なされます。

結果

この研究の主な目的は、マウスの味覚と嗅覚の相互作用を調査するための堅牢なフレームワークを確立することです。このフレームワークには、人工知能とQBAの使用が組み込まれており、予測分類モデルが開発されています。さらに、DLから得られた洞察は、内部の独立した分析のための定量的MGS評価と交差検証されます。この方法論の主な応用は、マウスが食事性アルコール飲料を嗅いだ?...

ディスカッション

この研究で味覚と嗅覚の相互作用を研究するために提案された方法は、Langfordらによって開発されたマウスの痛みの顔面表現のための行動コーディングの元の方法に基づいています16。最近発表されたいくつかの記事では、マウスの顔の自動追跡とその後のMGSスコア21、26、27、28?...

開示事項

著者は、利益相反がないことを宣言します。

謝辞

Z. Caiは、Kwok Yat Wai Endowed Chair of Environmental and Biological Analysisの設立にあたり、Kwok Chung Bo Fun Charitable Fundからの財政支援に感謝いたします。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Absolute ethanol (EtOH)VWR Chemicals BDHCAS# 64-17-5
Acrylonitrile butadiene styrene bricksJiahuifeng Flagship Storehttps://shop.paizi10.com/jiahuifeng/chanpin.html
Acrylonitrile butadiene styrene platesJiahuifeng Flagship Storehttps://shop.paizi10.com/jiahuifeng/chanpin.html
Allyl isothiocyanate (AITC)Sigma-AldrichCAS# 57-06-7
Anhydrous dimethyl sulfoxideSigma-AldrichCAS# 67-68-5
Chinese spiritYanghe Qingcihttps://www.chinayanghe.com/article/45551.html
Commercial wasabiS&B FOODS INC.https://www.sbfoods-worldwide.com
Formic acid (FA)VWR Chemicals BDHCAS# 64-18-6
GraphPad Prism 5GraphPadhttps://www.graphpad.com
HPLC-grade acetonitrile (ACN)VWR Chemicals BDHCAS# 75-05-8
HPLC-grade methanol (MeOH)VWR Chemicals BDHCAS# 67-56-1
Microsoft Excel 2016Microsofthttps://www.microsoft.com 
Microsoft PowerPoint 2016Microsofthttps://www.microsoft.com
Milli-Q water systemMilliporehttps://www.merckmillipore.com
Mouse: ICRLaboratory Animal Services Centre (The Chinese University of Hong Kong, Hong Kong, China)N/A
Peanut butterSkippyhttps://www.peanutbutter.com/peanut-butter/creamy
Python v.3.10Python Software Foundationhttps://www.python.org 
Transparent acrylic platesTaobao Storehttps://item.taobao.com/item.htm?_u=32l3b7k63381&id=60996545797
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EHU

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