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この記事について

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要約

このプロトコルは、雌豚の開腹 術を介して クローン化されたブタの胚を移植するために使用される外科的技術の適用を説明しています。

要約

このプロトコルは、クローン化されたブタの胚を卵管に移植するための外科的技術を実証することを目的としています。これは、生物医学研究のための遺伝子組み換えブタの製造に広く使用されている方法です。9匹の雌豚は、体細胞核移植(SCNT)によって生成されたクローン胚を2日目に最大4細胞の段階で卵管に移すためにホルモン同期と開腹術を受けました。妊娠診断は、移植手術の30日後に超音波検査 によって 行われました。手術を受けた9頭の雌豚のうち6頭は、超音波検査で妊娠の兆候を示しました。しかし、超音波検査で評価した胎児の発育に進行がなかったため、雌豚は生物学的物質の収集と生殖器系の評価のために60日後に剖検を受けました。癒着は、子宮角、卵巣、卵管に観察されました。安楽死させた雌豚のうち2雌豚の子宮内腔から、妊娠期間が12〜20日の1つと4つの胚構造が得られました。生きた子豚がいないにもかかわらず、これはおそらくクローンブタ胚の移植効率が低いことに起因すると考えられます。これは、移植された胚の数や質などのさまざまな要因に影響されますが、提示された外科的技術は迅速かつ安全であることが証明されました。

概要

ブタは、解剖学的、生理学的、遺伝的にヒトと類似しているため、生物医学研究の優れた実験モデルです1。これらの動物は、ヒトに移植されたときに拒絶反応のリスクが低い臓器、細胞、または組織を生成することを目的として、異種移植に関連する研究でよく使用されてきました。異種移植研究は、ヒト移植のための臓器供給を増やし、患者の待機リストを減らすことを目的としています2。

異種移植用のブタの生産には、遺伝子編集されたブタ細胞からのクローンの生産など、いくつかのステップが含まれます。遺伝子組み換えクローン胚の in vitro 生産後、胚は同期した発情周期で雌ブタの生殖器系に移され、新しい概念の受容と妊娠のための子宮生理機能を準備します3。

ブタの胚移植は、非侵襲的または侵襲的な方法4で行うことができます。非侵襲的な方法の中には、外科的介入を必要としない経頸部移植があります。しかし、この方法は、後の発生段階(すなわち、桑実胚または胚盤胞の段階)での胚移植に限定されており、カテーテル挿入部位または胚の沈着を正確に決定することはできません5。腹腔鏡検査と開腹術は、胚移植の侵襲的な方法と考えられています。腹腔鏡検査は侵襲性が低いですが、特定の高価な機器が必要であり、その効率は、生殖構造の操作の難しさや使用されるカテーテルの種類などのさまざまな要因により、大幅に異なります(20%未満から80%以上まで)4,6。したがって、腹腔鏡による移植は、開腹術による外科的移植方法と比較して、まだ効率が悪いです 4.

開腹 術による 雌豚の胚移植手術は、比較的簡単で迅速な手順であり、通常は約30分かかります。ただし、吸入麻酔器と専門チームを備えた手術センターで行う必要があります。商業豚(ランドレース、ラージホワイト、またはそれらの交雑種など)の場合、雌豚を持ち上げるためのホイストや、動物のかなりの体重(約130〜150 kg)のために、広くて頑丈な手術台などの特別な機器が必要です。

手術を成功させるためには、胚の発生段階を事前に評価する必要があります。最大4個の細胞の胚を子宮管に移すことが推奨されます。桑実胚や胚盤胞など、4細胞を超える段階の胚は、子宮角7,8に移植する必要があります。

世界中の研究グループが遺伝子組み換えクローンブタ胚の作製と外科的移植を行っていますが、ビデオを通じてこの手順を実証する明確に定義されたプロトコルはまだありません。この手法では、卵管の正確な位置に胚を正確に沈着させる必要があり、卵管のオスチウムの局在化と胚を含むピペットの導入が含まれるため、このアプローチは妊娠の成功にとって非常に重要です。この手法は、手順全体の説明ビデオを通じてより理解できます。したがって、この記事は、クローン胚を雌豚の卵管に移植するための開腹手術を実証することを目的としています。これは、異種移植またはその他の関連目的に使用される遺伝子組み換えブタの将来の生産に不可欠な前提条件です。

プロトコル

この研究は、サンパウロ大学の獣医学部および動物科学部の研究における動物使用に関する倫理委員会によって承認されました(プロトコル番号6088030523)。ブラジルのサンパウロ州イトゥ市にあるÁgua Branca核養豚農場の生後7ヶ月齢の雌豚9雌豚を、2回目の発情検出の直後に使用した9。本試験で使用した試薬および機器の詳細は、 資料表に記載されています。

1.動物の調理

  1. 動物を12時間絶食させ、外科的処置の4時間前に水へのアクセスを制限します。
  2. 40 mm x 12 mmの針を使用して、同じ50 mLシリンジに10 mg / kgのケタミンと0.2 mg / kgのミダゾラムを吸い上げます。.シリンジをIV投与セットに取り付けて、投薬を容易にし、動物から安全な距離を保ち、動物が自由に動くようにします。
  3. 外耳道の尾側にある僧帽筋への筋肉内注射 を介して 麻酔前薬を投与します。
  4. 20 G カテーテルで耳介静脈をカニューレ挿入し、0.9% NaCl 溶液を 10 mL/kg/h の速度で術中輸液療法用のマクロドリップ投与セットに接続します。
  5. 4 mg / kgのプロポフォールで麻酔を静脈内投与します(施設で承認されたプロトコルに従います)。
  6. 喉頭鏡とカフ10付きのサイズ9の中気管チューブを使用して、動物の口腔気管挿管を行います。
  7. 1.5%から2%のイソフルラン吸入で麻酔を維持します。.さらに、毎分100〜120拍に維持する必要がある心拍数、99%から100%に維持する必要がある酸素飽和度、筋肉の弛緩、動きの欠如、反射の評価などの生理学的パラメーターを評価して、麻酔を監視します。
    注:体温も監視および制御し、37.5〜38.5°Cに保たれるようにする必要があります。 必要に応じて、イソフルランに加えて、プロポフォールを使用してパラメータの制御を維持することができます。塩酸フェンタニルは、鎮痛剤として20分ごとに0.02 mg / kgの用量で投与する必要があります。.すべてのパラメータは5分ごとに記録する必要があります。
  8. 0.002 mg / kgのフェンタニルを静脈内投与し、4 mg / kgの塩酸トラマドールを筋肉内投与して周術期鎮痛を筋肉内投与します。
  9. 心臓電極を胸部に配置して、心拍数の術中モニタリングを行います。心拍数、直腸温、酸素飽和度を5分ごとに記録します。

2.外科的処置

  1. 金箔を背側横臥の手術台に置きます。
  2. 手術野の汚染を最小限に抑えるために、動物の足を手技用手袋で覆います。
  3. 外科的クリッパーを使用して、乳腺の最後から2番目のペアの間の腹側尾腹部の脱毛を行います。
  4. クロルヘキシジンを含浸させた消毒ブラシを使用して術前の皮膚消毒を行い、臍の瘢痕領域から乳腺の最後のペアまで円を描くように動かします。清潔で湿らせた湿布でクロルヘキシジンを取り除きます。.
  5. 外科医と助手が外科的消毒を行い、手術用の滅菌手術用ガウンと手袋を着用していることを確認してください。
    注:動物は、手術部位とは別の準備エリアで手術の準備をする必要があります。
  6. 材料表に記載されている適切な以前に滅菌された器具を使用して、手術台を準備します。
  7. 滅菌ガーゼとクロルヘキシジン消毒剤を使用して最終的な外科野外消毒を行い、切開部位から始まり横方向に拡大するフィッシュボーンパターンで領域を洗浄します。
  8. クロルヘキシジン消毒剤でこの手順を3回繰り返し、次にアルコール性クロルヘキシジンでこの手順を繰り返します。
  9. 動物を滅菌外科用ドレープで完全に覆い、はさみを使用して、ドレープが開窓されていない場合は、外科用ドレープに約10 x 20cm²の長方形の開口部を作成します。
  10. 外科的ドレープを鼠径乳腺の最後から2番目のペアの上に置きます。4つのバックハウスクランプを配置して、動物の皮膚に外科用ドレープを固定します。
  11. メスで皮膚を切開し、長さ約10cmの切開を行います。
  12. 止血鉗子および/または吸収性縫合糸サイズ 2 で皮下血管の止血を達成します。
  13. 指または先の尖ったハサミを使用して皮下組織を解剖し、切開部を深くして腹部の筋肉組織の 白筋線 に到達します。
    注:腹部の正中線を触診して、より硬くて繊維質の領域としてalbaの線を感じます。腹直筋の分離を観察し、解剖しながら組織の一貫性の変化に注意して、 alba線 を正確に特定します11。
  14. アリス鉗子で筋肉をつかんで持ち上げると、メスで albaのライン を刺します。
  15. 人差し指を切開部に挿入して、癒着の有無を評価します。他の臓器や基礎となる構造を傷つけないように、鈍い/鈍いまたは細かい/鈍いハサミで、リネアアルバの切開部を尾側と頭蓋方向に慎重に伸ばします。
  16. 外科医の片手を腹腔に挿入して子宮角や卵巣を見つけて外出できるように、十分な長さの切開を行います。Gossetリトラクターは、腹腔への侵入と、処置終了時の筋肉組織の単層縫合を容易にするために使用することができます。
  17. 子宮角の1つが卵巣の前に位置している場合は、子宮角の先端と同側の卵巣に到達するまで、それをゆっくりとたどります。この手順では、子宮内の体液の存在を評価します。これは妊娠を損なう可能性があります。
  18. 卵巣の位置を特定したら、そっと引っ張って慎重に露出させます。排卵前の卵胞、出血性黄体、環状黄体、およびアルビカンスの存在を評価して、雌豚の同期が予想どおりであるかどうかを評価します。
  19. 卵巣を覆っている子宮管の線毛をそっと取り除き、その粘膜を切除し、子宮管の口を見つけます。
    注:外科医が線毛の口を特定するのが難しいと感じた場合は、血管に穴を開けるのを避けて、卵管の膨大部にポケットを丸い体の縫合針で挿入し、胚を含むトムキャットカテーテルを挿入することができます。
  20. 胚を含むトムキャットカテーテルを線毛の口に慎重に挿入し、子宮管の膨大部に到達するまで挿入します。
  21. 1mLのシリンジをTomcatカテーテルに取り付けて、胚を含む液体を子宮管に押し込みます。線毛で卵巣を覆い、腹腔に戻します。
  22. 反対側の子宮角と卵巣の位置を特定し、手順2.17-2.21を繰り返します。
  23. 腹腔内の構造を再配置し、腹腔内を温めた生理食塩水1 Lまたはリンゲル乳酸溶液(39°C)を追加して、腹部の癒着を防ぎます。
  24. 吸収性縫合糸サイズ2で腹部の筋肉組織を「X」ステッチ(スルタン)で縫合します(スルタン)。
  25. 吸収性縫合糸サイズ2を使用して、連続マットレス縫合糸で皮下組織を近似します。
  26. サイズ2のナイロン縫合糸で、中断された単純なステッチ、外科用ステープル、またはエチルシアノアクリレート接着剤で皮膚を閉じます。この手順では、接着剤の使用を選択しました。
  27. 過酸化水素に浸したガーゼで手術創部を洗浄し、湿布で乾燥させて、外科用創傷部への外科用接着剤の固定を強化します。リファマイシンまたはピアソン軟膏を塗布し、ガーゼで覆い、最後に外科用接着剤を塗布します。
    注:傷口は包帯で5日間閉じたままにしておく必要があります。

3. 術後ケア

  1. Luna et al.12 によって提案されたスケールに従って、少なくとも次の 3 日間連続して、特徴的な臨床的疼痛の兆候について動物を評価します。
    注:このスケールは、姿勢、相互作用、環境への関心、活動、食欲、患部への注意など、さまざまなレベルの痛みを経験したときに豚が示すさまざまな行動に基づいています。スコアの範囲は、評価される各パラメーターについて、示される動作のタイプに応じて 0 から 3 です。評価の終了時には、すべてのスコアの合計は、動物が経験した痛みの強度を反映しており、0は痛みがないことを表し、18は非常に激しい痛みを表します12。
  2. 術後ケアとして、15 mg / kgのアモキシシリンと0.4 mg / kgの2%メロキシカムを1日1回(臀筋または頸筋で)筋肉内(臀筋または頸筋)に単回投与し、痛み、炎症過程、感染を防ぎます。.
    注:痛みのスコアが使用される痛みのスケール(0から18のスコア)で6以上の場合、抗炎症薬と抗生物質に加えて、1日1回、ジピロンナトリウムナトリウム5,000 mg /動物を筋肉内(臀筋または頸筋)に投与します。.または、地域の IACUC ガイドラインに概説されているように鎮痛を行います。
  3. 手術後6日目に、2%アルコール性クロルヘキシジン溶液に浸したガーゼで創傷洗浄用の外科用接着剤を取り除き、10日目まで局所ピアソン軟膏を塗布します。このとき、抜糸または外科的ステープルの除去(使用する場合)が推奨されます。

4. 妊娠の超音波検査による妊娠診断

  1. 胚移植手術の30日後に超音波装置(周波数範囲4.5〜8.5 MHz)を使用して経腹部妊娠超音波評価を行います。
  2. 超音波ジェルをプローブに塗布し、腹部の鼠径部の近くに内側を向いて配置します。
    注:子宮内腔内の液体による丸みを帯びた無響胚小胞の視覚化は、妊娠を示しています。子宮内液の非可視化、または胚小胞の描写のない子宮内液の存在は、妊娠の欠如を示唆しています。

5.動物の安楽死

注:超音波検査で妊娠期間に対応するサイズと外観の胎児を示さなかった雌豚を安楽死させます。

  1. 40 mm x 12 mmの針を使用して、静脈内投与セットに取り付けられた同じ50 mLシリンジに15 mg / kgのケタミンと2 mg / kgのミダゾラムを引き出し、麻酔前薬として、外部耳道の尾側である頸部の僧帽筋に筋肉内投与します。.
  2. 20 G カテーテルで耳介静脈をカニューレ挿入し、徐脈が発生するまで 4 mg/kg のプロポフォールをボーラスに静脈内麻酔します (施設で承認されたプロトコルに従います)。
  3. その後、10〜20mLの19.1%塩化カリウムを静脈内投与します。.心領域に聴診器を置いて、呼吸運動の欠如、粘膜の青白さ、角膜反射の喪失、心拍の欠如を観察して、心肺停止を確認します。
  4. 剖検された女性13 からあらゆる種類の子宮内内容物(胚組織、液体、または粘液分泌物)を収集し、それを微生物学的分析のために転送して、可能性のある病原体を検出し、クローンの遺伝子型特性評価(必要な場合)のためにも転送します。黄体、卵巣嚢胞、異常な分泌物、および子宮、卵巣、卵管の癒着の発生の有無を視覚的に確認します14。

結果

この記事は、クローン胚を雌豚の卵管に移植するための開腹手術を実証することを目的としています。すべての動物は適切な麻酔面に留まり、麻酔回復中の術中の事故や合併症はありませんでした。雌豚は、手術終了後に立ち上がるのに平均して2〜3時間かかりました。

すべての外科的処置は、平均して44分続きました。9雌豚が手術を受け、雌?...

ディスカッション

記載されている外科的方法は、クローンブタまたは遺伝子組み換えクローンブタの生産に取り組む他の研究グループによって以前に行われており、この技術の実施後の出生の報告があります15,16,17,18,19,20。さまざまな細...

開示事項

著者のいずれも利益相反を開示していません

謝辞

サンパウロ大学獣医学部の馬動物病院および反芻動物病院(FMVZ/USP)、ブラジル・サンパウロ、FAPESP(助成金2022/11459-3、サンパウロ研究財団)、EMS Pharma、CNPq(助成金405254/2022-9)、ブラジル・サンパウロ州イトゥのÁgua Branca養豚病院に感謝いたします。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25 mL strawgeneric-Surgical material
1 mL syringeDescarpack341001Surgical material
10 mL syringeDescarpack324601Surgical material
20 mL syringeDescarpack324801Surgical material
3 mL syringeDescarpack324201Surgical material
5 mL syringeDescarpack324401Surgical material
60 mL syringeDescarpack323201Surgical material
9 mm endotracheal tubeRusch112482-000090Surgical material
Allis forcepsgeneric-Surgical instrument
Amox LAJA Saúde AnimalMAPA registration: 8.781/2004Pharmaceutical drug
Bakhaus forcepsgeneric-Surgical instrument
Catheter 20GDescarpack362401Catheter for intravenous access
CetaminAgener UniãoMAPA registration: SP-000292-5.000011 Anesthetic
Conductive clinical gelRMCANVISA registration: 80122200013Surgical material
Dipyrone D-500ZoetisMAPA registration: SP0000728-46Pharmaceutical drug
Disposable scalpel n. 22WiltexANVISA registration: 10150470565Surgical instrument
Disposable sterile sponge-brushRioquimica7.89778E+12Surgical asepsis
Easy-Scan:GoIMVESCG01Ultrasound
Endozime AW PlusRuhof34514Detergent for surgical instruments
Fentanil (Fentanest)CristáliaANVISA registration: 1029800810159Anesthetic
Gosset retractorgeneric-Surgical instrument
Halstead-mosquito hemostatic forcepsgeneric-Surgical instrument
Healing ointment - Unguento PearsonPearson SAMAPA registration: SP0000094-16Pharmaceutical drug
hydrogen peroxide solutionRioquimicaANVISA registration: 218690015Surgical material
IsofluoraneBiochimicoANVISA registration: 100630222Anesthetic
IV Drip set extensorgeneric-Fluid therapy
IV Macro drip setDescarpack410301Fluid therapy
Lactofur (ceftiofur)Ourofino SAMAPA registration: SP0000051-50Pharmaceutical drug
Laringoscope--Surgical instrument
Maxicam 2%Ourofino SAMAPA registration: SP0000051-69Pharmaceutical drug
Micropore adhesive 5 cm x 10 cm generic1530Surgical material
MidazolamHipolaborANVISA registration: 1134301430035Anesthetic
Multi-Way IV Infusion SetDescarpack413201Fluid therapy
Needle 40 mm x 1.2 mmDescarpack353601Sterile needle for applying medicines and anesthetics.
Needle 40 mm x 1.6 mmWiltexANVISA registration: 10150470664Sterile needle for applying medicines and anesthetics.
Needle holdergeneric-Surgical instrument
Nylon 2 suture trheadShalon MedicalN502CTI40Surgical material
Ordinary pengeneric-Regular pen for taking notes
Physiological solution 0.9% 500 mL bagJP FarmaMS:1.0491.0070Fluid therapy
Polyglycolic acid 2 suture threadAtramatG4099-75HSurgical material
Potassium chlorideSamtecANVISA registration: 1559200010139Parenteral drug
Procedure glovesDescarpack122401Personal Protective Equipment (PPE)
Propofol (Provive)União QuímicaANVISA registration: 1049714490057Anesthetic
Ringer lactate solution 500 mL bagJP FarmaMS:1.0491.0061Fluid therapy
Riohex 0.5% clorexidine alcohol solutionRioquimica218690356Surgical asepsis
Riohex 2% clorexidine solution with surfactantRioquimica218690356Surgical asepsis
Scalp 21 GDescarpack421201Surgical material
Shoe coversgeneric-Personal Protective Equipment (PPE)
Sterile compressesCremerANVISA registration: 10071150065Surgical material
Sterile gauze padProcitexANVISA registration: 80245210083Surgical material
Sterile surgical drapes 140 cm x 90 cm Venkuri7010003Surgical material
Sterile surgical drapes 150 cm x 190 cm PolarFixF00208Surgical material
Sterile surgical glovesMucamboCA: 39.317Personal Protective Equipment (PPE)
Stethoscopegeneric-Surgical equipment
Surgical capDescarpack93201Personal Protective Equipment (PPE)
Surgical gownDescarpack231101Personal Protective Equipment (PPE)
Surgical maskDescarpack110701Personal Protective Equipment (PPE)
Surgical scissors blunt-bluntgeneric-Surgical instrument
Surgical scissors sharp-sharpgeneric-Surgical instrument
Surgical staplerTradevet-Surgical material
Tekbond super glueTek Bond78072720030Surgical material
Thermometergeneric-Surgical equipment
Three Way StopcockSolidor374Surgical material
Tramadol hydroclorideAgener UniãoMAPA registration: SP-000292-5.000002Anesthetic
Transparent film dressingSkinupperANVISA registration: 82307460014Surgical material
Waterproof adhesive 10 cm x 4.5 cm generic364828Surgical material

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