マウス網膜神経節細胞のホールマウント免疫染色および自動計数(英語)

要約

このプロトコルは、ホールマウントマウス網膜を単離し、免疫染色を実施してすべての網膜神経節細胞(RGC)を標識する手順を説明しています。このプロセスに続いて、AIベースのソフトウェアを使用してRGCをイメージングし、自動的にカウントし、マウス網膜全体のRGCを定量するためのシンプルで高速かつ正確な方法を提供します。

要約

緑内障は、世界的に失明の主な原因であり、視力回復を困難にする複雑な病原性メカニズムを特徴としています。マウスは、比較的均質な遺伝的背景と、構造的にヒトに類似した網膜神経節細胞(RGC)により、緑内障の病因と治療を研究するための貴重な動物モデルとして機能します。マウス緑内障モデルにおけるRGC損傷と治療結果を正確に評価するには、網膜全体にわたるRGC数を決定する必要があります。このプロトコルは、網膜全体の単離、特定の抗体によるRGCの標識、AIベースのプログラムを使用したRGCの迅速で正確な自動カウントを含む包括的な方法を概説しています。この合理化されたアプローチにより、マウス網膜のRGC数を効率的かつ正確に定量化することができ、RGC変性の評価や治療介入の可能性を高めることができます。研究者がRGC損傷の程度を評価できるようにすることで、このプロトコルは緑内障の病因のより深い理解に貢献し、視力喪失を管理および予防するための効果的な治療戦略の開発を支援します。

概要

緑内障は、神経節細胞の進行性の死を特徴とし、視力回復に大きな課題をもたらします^1,2。この病気は、その有病率と視力への影響により、眼科研究の主要な焦点です³.マウスモデルは緑内障に欠かせません
その均質な遺伝的背景、高い生殖能力、および神経節細胞の特性とヒトとの類似性による研究⁴。この方法の主な目標は、マウスモデルにおける網膜神経節細胞(RGC)を正確に定量することであり、これは緑内障の病因を理解し、関連する治療法を開発するために不可欠です。

この手法を開発した根拠は、マウスモデルにおけるRGC変性を評価するための信頼性と効率性に優れた方法の必要性に起因しています。網膜切片におけるRGCの標識などの従来の方法では、網膜5におけるRGCの分布が不均一であるため、信頼性の低い結果が得られる^{ことがよくあります。}網膜全体にわたるRGCの定量化は、その数の変化をよりよく反映し、疾患の進行と治療介入を評価するために重要です。

この方法には、他の手法に比べていくつかの利点があります。例えば、40,000〜....

プロトコル

この手続きは、研究における動物の使用に関するAssociation for Research in Vision and Ophthalmology(視覚眼科学研究協会)のガイドラインに準拠しており、四川省人民病院の動物管理・使用委員会(IACUC)によって承認されました。この研究では、C57Bl/6J雄マウス(生後2か月)を使用しました。 図 1 は、ここで説明する全体的な手順を示しています。使用した試薬や機器の詳細は 、資料表に記載されています。

1. ホールマウント網膜の分離

1. 動物の犠牲
   1. 子宮頸部脱臼を使用してマウスを犠牲にします(施設で承認されたプロトコルに従います)(図2A)。頸部脱臼の前に、
      イソフルラン(酸素中3%〜5%)を吸入するか、ケタミン/キシラジン混合物の腹腔内注射により、マウスに麻酔をかけます。.
2. 核形成と眼球処理
   1. 眼球の背側にある角膜の端に青いマーカーで印を付けて、その後の解剖時に向きを覚えておきます。
   2. 眼球に付着した残存筋組織をハサミで取り除きます。除核した眼球を、1x PBSを....

ディスカッション

このプロトコルは、マウス網膜中のすべての網膜神経節細胞(RGC)を決定する方法を提供し、これは、緑内障研究のためのマウスモデルにおけるRGC変性の進行を監視するために使用することができます。マウスの網膜はデリケートな神経組織⁵であり、マウスの眼から全身網膜を分離するには繰り返しの練習が必要です。実験中に、固定時間が網膜の形.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1× PBS	Servicebio	G4202
Alexa594-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG  (H+L)	ThermoFisher	A-11012
Anti-BRN3A antibody [EPR23257-285]	Abcam	ab245230
AutoCount software			https://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs
Cloud disk	Google drive link		https://drive.google.com/file/d/1yOEsBvil6KEdZFa5ENQxB6
Cloud disk	Baidu link	Extraction code: g44k	https://pan.baidu.com/s/1lccg1OVbeudsp2VtnqxWZg
Marker	Sharpie
Normal Donkey Serum	Biosharp, Labgic	25030081
Paraformaldehyde	Macklin	P804536
ProClean 300	Beyotime	ST853
Sucrose	BBI, Sangon	A610498
Triton X-100	BioFroxx, neoFroxx	1139ML100