小腸および大腸単分子膜界面を用いたウシオルガノイド技術の進歩

要約

この研究は、オルガノイドからウシ腸の2D単分子膜を生成するためのプロトコルを提示し、宿主と病原体の相互作用を研究するためのアクセスを改善します。これには、膜の完全性と機能性を評価する方法が含まれており、牛の胃腸生理機能を模倣した in vitro モデルを進歩させています。このアプローチは、治療戦略の強化など、生物医学的および農業上の大きな利益を約束します。

要約

消化器生理学とその疾患に関する知識の進歩は、in vivo腸組織を忠実に模倣する正確な種特異的なin vitroモデルの開発に大きく依存しています。これは、深刻な公衆衛生上のリスクをもたらす病原体の重要な貯蔵庫であるウシの宿主と病原体の相互作用を調査するために特に重要です。従来の3Dオルガノイドは、腸管上皮の頂端表面へのアクセスが限られており、2D単分子膜培養の出現によって克服されたハードルでした。オルガノイド細胞に由来するこれらの培養物は、よりアクセスしやすい研究のための露出した管腔表面を提供します。本研究では、ウシの小腸オルガノイドおよび大腸オルガノイドの細胞から2次元単層培養物を作製し維持するための詳細なプロトコールを紹介します。この方法には、経上皮電気抵抗および傍細胞透過性による膜の完全性を評価するためのプロトコルと、免疫細胞化学染色技術が含まれます。これらのプロトコルは、2Dウシ単層培養システムの確立と特性評価の基礎を築き、公衆衛生上重要な生物医学およびトランスレーショナル研究におけるこれらのメソッドアプリケーションの限界を押し広げます。この革新的なアプローチを採用することで、牛の腸生理学の正常な状態と病気の状態の両方を調べるための生理学的に適切なin vitroモデルの開発が可能になります。生物医学と農業の進歩への影響は深く、牛の腸疾患に対するより効果的な治療への道を開き、それによって動物福祉と食品の安全性の両方を向上させます。

概要

腸管オルガノイドとして知られる3次元(3D)培養物での腸上皮幹細胞の培養は、腸の機能、栄養、および病原体との相互作用を調査するためのin vitro技術における大きな進歩を示しています^1,2。これらのオルガノイドは、自己複製し、さまざまな腸細胞系統を包含する3D形成に組織化することにより、in vivo腸上皮の複雑な構造を模倣します³。この特徴は、腸内生物学の理解を前進させる彼らの大きな可能性を浮き彫りにしています。

腸内オルガノイド技術を家畜に応用することへの関心が高まっているため、培養と維持技術の改良が必要とされている^4,5。この技術の関連性は、家畜の腸内健康の研究に潜在的な影響を与えることで強調されており、これは家畜の生産性に重要な役割を果たし、その結果、動物福祉と運用コストに影響を与えることにより、食用動物産業の経済性に重要な役割を果たします^6,7。具体的には、サルモネラ属菌や大腸菌(大腸菌)O157:H7⁸などの人獣共通感染症の腸内病原体の貯蔵庫としての役割を考えると、ウシの腸内オルガノイド培養を使用して腸内オルガノイド培養を使用することが最も重要です。これらの病原体は腸の特定の部分に局在しているため、研究の精度を高めるためには、腸内オルガノイド培養法を腸内セグメントごとに区別することが不可欠です⁹。

腸オルガノイドの研究における大きな障害は、上皮細胞の頂端表面へのアクセスが制限されていることである¹⁰。細胞外マトリックス(ECM)内で培養すると、細胞は自然に向きを変え、基底面が外側を向き、頂端面が内側を向くようになる¹⁰。この課題に対処するために、3Dオルガノイドを単一細胞に解離し、それらを半透過性の細胞培養インサートに播種する方法が提示されています。このセットアップにより、頂端面と基底外側コンパートメントとの間にインターフェースが確立されます。このプロトコルは、ウシ腸オルガノイドに由来する細胞が、経上皮電気抵抗(TEER)測定および傍細胞透過性アッセイによって証明されるように、コヒーレントな2D単層を形成できることを実証しています。さらに、オルガノイド由来の2D単層細胞におけるブラシ境界とタイトジャンクションによる細胞極性の発達は、免疫蛍光法と電子顕微鏡法によって確認されており、 これはin vivo 腸上皮の特性を反映しています。

この研究では、回腸は小腸管を表し、直腸は大腸管を意味します。これらの選択は、回腸¹¹を転座させることができるサルモネラ属菌や、主に牛の直腸⁹にコロニーを形成することが知られている大腸菌O157:H7などの関連する腸管病原体に基づいています。これらの特定の腸セグメントの選択は、研究の精度を高めるために腸内オルガノイド培養法を腸領域に合わせて調整する必要性を浮き彫りにしています。これらの方法は、これらの腸セグメントからオルガノイド由来の2D単層界面を効果的に培養する手順を詳しく説明し、牛の腸の健康、病原体感染、および腸内細菌叢と宿主との間の相互作用を調査するための堅牢なモデルを提供します。

プロトコル

腸内陰窩は、地元の食肉処理場で調達された余剰の腸内標本から調達され、ドナーの信号は 補足表1に記載されています。オルガノイドは、屠殺場で人道的に安楽死させた動物に由来する組織を用いて作製したものであり、この研究のためだけに動物を調達したわけではありません。したがって、この研究は IACUC レビューから免除され、倫理ステートメントは適用されません。

1. オルガノイド由来の2D単分子膜培養のための細胞培養インサートへのECMコーティング

注:すべての手順は、バイオセーフティキャビネット内の滅菌材料と無菌技術を使用して実行されます。すべての試薬は、特に明記されていない限り、手順全体を通して氷上に保管されます。

1. 0.33 cm² 細胞培養インサート各100 μLをコーティングするために、基礎培地と2%(v/v)ECMベースのハイドロゲルをマイクロチューブ内で完全に混合して、ECMを調製します。
2. 滅菌した鉗子でパッケージから個々の細胞培養インサートを取り出し、24ウェルの透明で平底の細胞培養プレートのウェルに個別に入れます。
3. ステップ1.1で調製したECMコーティング100μLを、ステップ1.2で調製した各細胞培養インサートのアピカルチャンバーに塗布します。
4. 蓋を元に戻し、コーティングされた細胞培養インサートを含む細胞培養プレートを加湿インキュベーターで37°Cおよび5%CO₂ で1時間インキュベートします。
   1. 回腸オルガノイド細胞の場合、インサートは1時間のインキュベーション後にすぐに使用できます。直腸オルガノイド細胞の場合、1時間のインキュベーション後、ECMコーティングを直腸単層培養培地に交換し、一晩インキュベートします(表1)。TEER測定を実行する場合は、ブランクコントロール用の追加の細胞培養インサートを準備します。

	回腸	直腸
ECMコーティングのインキュベーション時間	1時間	1 時間後に 単層培養培地で一晩
サプリメント オルガノイド培地
		CHIR99021
	LY2157299	LY2157299
	Y-27632	Y-27632
	ウシ胎児血清	ウシ胎児血清
細胞播種密度(細胞/ウェル)	5×105	3×105

表1:成体ウシ回腸オルガノイドおよび直腸オルガノイドに由来する2D単分子膜を作成するための最適化されたプロトコルの要約。

2. ウシ回腸オルガノイドおよび/または直腸オルガノイド細胞の播種と2D単層培養

注:このセクションで説明するプロトコルは、記載されている技術⁵を使用して48ウェルプレート上で培養および維持されたウシ回腸および直腸オルガノイドを使用します。最適な結果を得るには、最初の樹立から3回以上経過し、直近の継代から3日以上経過して培養された、安定して維持されたオルガノイドを使用することが推奨されます。

1. 成熟オルガノイドを含むECMベースのハイドロゲルドームを乱さずに、真空システムに取り付けられた使い捨てガラスパスツールピペットを使用してオルガノイド培養培地を取り出し、ウェルあたり300 μLの氷冷ECM解重合溶液を加えます。4°Cで少なくとも1時間インキュベートします。
   注:あるいは、ECM解重合溶液を添加した後、ECMベースのハイドロゲルドームを含むオルガノイドを機械的に破壊し、4°Cでインキュベートする前に15mLのコニカルチューブに懸濁液を回収します。 この方法は、2D単層培養に使用しないオルガノイドを同じプレート上で同時に培養する場合に推奨されます。オルガノイド培養の密度は、細胞培養インサートへの最適な播種に必要なオルガノイド培養ウェルの数に大きく影響します。
   1. 高密度オルガノイド培養(補足図1A)の場合、直腸細胞培養インサートは1:1〜1:2の範囲の播種比を使用します。これは、1つの培養ウェルで1〜2ウェルの播種が可能であることを意味します。回腸の場合は、比率を1:1に保ちます。対照的に、低密度の培養(補足図1B)では、より多くの培養ウェルが必要です。1つの直腸細胞培養インサート(3-4:1の比率)には3-4の直腸オルガノイド培養ウェルを使用し、1つの回腸細胞培養インサート(4-5:1の比率)には4-5回の回腸オルガノイド培養ウェルを使用します。
2. ECMベースのハイドロゲルが完全に溶解するかどうかを目視検査し、オルガノイド懸濁液を15 mLのコニカルチューブに回収します。
3. オルガノイドを200 x g 、4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨てます。ペレットを10 μM Y-27632を添加した組換え細胞解離酵素溶液1 mLに再懸濁します。
4. オルガノイド懸濁液を37°Cの水浴で10分間インキュベートし、3〜5秒を断続的に振とうし、2〜3分ごとに渦を巻き起こして、効果的なオルガノイドの解離を促進します。
5. 酵素消化後、5 mLの基礎培地を加え、P1000マイクロピペットで積極的にピペットでピペット操作を行い、オルガノイドをさらに破壊して単一細胞にします。懸濁液にオルガノイドの塊がないか検査し、それでも視覚的に確認できる場合は、ピペッティングを繰り返して単一細胞の解離を促進します。
6. 50 mLのコニカルチューブと70 μmのセルストレーナーを調製します。1〜2mLの基礎培地を塗布して、ストレーナーを事前に濡らします。
7. ストレーナを介して細胞懸濁液をろ過し、残留ECMベースのヒドロゲル破片や大きな細胞塊を除去します。元の15 mLチューブと70 μmセルストレーナーを、さらに10 mLの基礎培地ですすいでください。
   注:細胞懸濁液がストレーナを容易に通過しない場合は、オルガノイドの不完全な解離を示している可能性があります。回収した細胞懸濁液を同じ70 μmの細胞ストレーナに再通過させることを試みることができます。追加の酵素的または機械的な混乱が必要になる場合があります。.
8. ペレット単細胞懸濁液を200 x g および4°Cで5分間遠心分離します。上清を除去し、細胞を適切な量の基礎培地で再懸濁して細胞数を計数します。
9. トリパンブルー染色後に血球計算盤で生細胞をカウントし、収集された細胞の総数を計算します。
10. ペレット単細胞懸濁液を200 x g および4°Cで5分間遠心分離します。上清を除去し、細胞をそれぞれの単層培養培地で適切な播種密度に再懸濁します(表1)。
    1. 回腸オルガノイド細胞については、500 nM LY2157299、10 μM Y-27632、および20%ウシ胎児血清(FBS)を添加したオルガノイド培地である200 μLの回腸単層培養培地で、細胞培養インサートあたり5 x 10⁵細胞/mLの播種密度を達成するために、細胞を2.5 x 10⁶細胞/mLの濃度に再懸濁します。
    2. 直腸オルガノイド細胞の場合、100 nM CHIR99021、500 nM LY2157299、10 μM Y-27632を添加したオルガノイド培養培地である200 μLの直腸単層培養培地で、細胞培養インサートあたり3 x 10⁵細胞/mLの播種密度を達成するために、細胞を1.5 x 10⁶細胞/ mLの濃度に再懸濁します。 および20%FBS。
11. ECMコーティングされた細胞培養インサートを備えた24ウェル細胞培養プレートを取り出し、コーティングを乱さないように慎重に真空吸引して細胞培養インサートの頂端チャンバーを空にします。
12. ステップ2.10で調製した200 μLのシングルセル懸濁液を、細胞培養インサートの頂端チャンバーに穏やかに適用します。ブランクコントロールには、アピカルチャンバーに細胞を含まない200 μLの培養培地を加えます。ブランクコントロールには、アピカルチャンバーに細胞を含まない200 μLの培養培地を加えます。
13. 適切に補充した単層培地500μL(回腸細胞と直腸細胞によって異なります)を各ウェルの基底外側チャンバーに適用します。
14. 加湿インキュベーターで37°C、5%_CO2 のインキュベートを行い、細胞の接着と増殖を促進し、細胞培養インサート上にコンフルエントな2D単分子膜を形成します。
15. 細胞播種から48時間後から、頂端室と基底外側室の両方で培養培地を隔日で交換します。ブランクコントロールと細胞含有インサートのインキュベーション時間を均等にします。

3. TEERの測定

注:ここで説明する方法では、一対のAg/AgCl電極を備えた上皮ボルトHM計として知られる市販の手動TEER測定システムを使用します(図1A)。2D単分子膜全体のTEERを測定するには、ブランクウェルの測定が必要です。ブランクの読み取り値がサンプルと同じ方法で取得されていることを確認してください。

1. オルガノイド由来の2D単分子膜とブランクの細胞培養インサートを含むプレートをインキュベーターから取り出します。プレートを室温に戻して約10分間待ちます。
2. 電極を70%エタノールで消毒し、完全に乾燥させます。
3. 短い方の端を頂端チャンバーに、長い方の端を基底外側チャンバーに含めて電極を慎重に導入します(図1A)。
   注:細胞単層を乱さないように、特に注意が必要です。
4. 読み取り値を平衡化させ、値が安定したらオーム単位で記録します。
   注意: 電圧抵抗計の感度は、電気抵抗測定中にオーム値の変動が発生するようなものです。信頼性の高い読み取り値は、測定値が安定し、一貫してプラトー値付近で推移しているときに得られます。
5. 次の式で2D単層のTEERを決定します。
   TEER(Ω x cm²)=細胞培養インサートの表面積(cm²)x正味の電気抵抗
   ここで、正味の電気抵抗は、セル単層インサートの測定された抵抗からブランクインサートの測定された抵抗を差し引いたものに等しくなります。24ウェルプレート用の細胞培養インサートの表面積は0.33 cm²です。

図1:ウシ腸管オルガノイド由来の2D単分子膜の上皮バリア完全性評価。 (A)TEER測定用の細胞培養インサートの頂端室および基底外側チャンバー内の電極の適切な配置の概略図。短い電極は頂端室に挿入され、長い電極はメンブレンとの接触を避けるために注意して基底外側のチャンバーに配置されます。(B)透過性アッセイプロセスの概略図。細胞培養チャンバーを温めたPBSで2回洗浄し、PBSに溶解した0.5 mg/mL 4 kDaのFITC-デキストラントレーサーをアピカルチャンバーに塗布します。ベースラテラルチャンバーから50μLのアリコートを繰り返し採取し、等量のPBSを置換してサンプリングし、インキュベーション期間中、ベースラテラルチャンバー内の総容量を維持します。アリコートの蛍光強度は、マイクロプレートリーダーを使用して測定され、細胞単層全体での4 kDaのFITC-デキストラントレーサーの拡散を定量化します。(C)回腸および直腸単層内のバリアインテグリティの経時的な動的発達は、TEER測定(回腸の閉じた円と直腸の閉じた正方形で表される)と透過性アッセイ(回腸の白丸と直腸の白四角で示される)を使用して評価されました4 kDa FITC-デキストラントレーサー。培養の3日目までに、両方のタイプの単層は、それぞれのTEERおよび透過性プロファイルによって証明されるように、安定で機能的な上皮バリアの確立を示しました。結果は、2つの技術的反復による少なくとも2つの独立した実験の平均です。エラーバーは、測定値のSEMを表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

4. パラセルファーマル透過性アッセイ

注:このアッセイには、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)-デキストランが頂端チャンバーから基底外側チャンバーに120分間にわたって2D単分子膜を横切って拡散することに起因する蛍光強度の測定が含まれます(図1B)。最適な結果を得るには、アッセイ中の光への曝露を最小限に抑え、蛍光の減少や消光を防ぐために、各サンプリングの直後にマイクロプレートリーダーで測定を行うことをお勧めします。各ウェルは一度しか使用できず、その後のアッセイで再利用することはできません。各アッセイのテクニカルレプリケートとして機能するように、少なくとも2つのウェルを準備します。例えば、 図 1C に示されている結果を得るには、合計 6 つのウェルが必要であり、アッセイは 3 つの異なる時点 (培養の 1、3、5 日目) で重複して実行されました。

1. リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に4 kDa FITC-デキストランで標準曲線希釈シリーズを調製します。希釈するごとに、50 μLを96ウェルプレートに3回ピペットで移します。
   注:0〜0.5 mg / mLの範囲の一連の5〜7希釈液を作成することをお勧めします。
2. 事前にキャリブレーションされたマイクロプレートリーダーで、励起波長495 nm、発光波長535 nmのスタンダードの蛍光強度を測定します。
3. 蛍光強度の結果を使用して線形回帰を計算し、標準曲線を作成します。
4. オルガノイド由来の2D単分子膜を含む細胞培養インサートを含むプレートをインキュベーターから取り出します。評価対象のオルガノイド由来の2D単分子膜を含む細胞培養インサートの頂端および基底外側チャンバーから単層培養培地を取り出します。
5. 各チャンバーを200μL(アピカルチャンバー)と500μL(基底外側チャンバー)の予熱済みPBSでそれぞれ2回穏やかに洗浄します。
6. アピカルチャンバーから洗浄液を取り出し、PBS中の0.5 mg/mL 4 kDaのFITC-デキストラントレーサー200 μLを細胞培養インサートのアピカルチャンバーにアプライします。
7. 加湿インキュベーターで37°C、5%CO₂ で20分間インキュベートします。
8. インキュベートした24ウェルプレートの基底外側チャンバーから50 μLをサンプル化し、マイクロプレートリーダー対応の96ウェルプレートに移します。
9. サンプリングしたウェルの基底外側チャンバー内の50 μLの新鮮なPBSを交換します。
10. すぐに、事前にキャリブレーションされたマイクロプレートリーダーで、励起波長495 nm、発光波長535 nmの蛍光強度測定を行います。
11. 手順4.6〜4.10を20分ごとに120分ごとに繰り返します。アッセイの最後に、2D単分子膜の保存が必要な場合は、頂端チャンバーと基底外側チャンバーの両方を新鮮なPBS 2xですすぎ、新鮮な単層培養培地と交換してインキュベートします。
    注:2D単分子膜のさらなる評価、すなわちTEER測定、免疫蛍光染色などを行うことができます。ただし、残留蛍光トレーサーが存在する可能性が高く、分析に影響を与える可能性があるため、推奨されません。
12. 見かけの透過係数 (P_app) を次の式で求めます。
    
    ΔQ / Δt = 特定の時間にわたって細胞培養インサートの基底外側チャンバーに単層を通過した蛍光トレーサーの濃度を、蛍光強度で測定し、標準曲線を介してμg/mLに外挿
    A = 細胞培養インサートの表面積
    C_o = 細胞培養インサートの頂端チャンバーに添加した蛍光トレーサーの濃度(μg/mL)

5. オルガノイド由来の2D単分子膜の免疫蛍光染色

1. 真空吸引で細胞培養インサートから単層培養培地を取り出し、200 μLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)を加えます。細胞固定のために室温で15〜30分間インキュベートします。
2. 真空吸引でPFAを除去し、100μLのPBS 2xで洗浄します。
3. PBS中の2%ウシ血清アルブミン(BSA)中の0.3% Triton X-100 100 μLで細胞を透過処理し、室温で10分間インキュベートします。
4. 真空吸引で上澄みを取り除き、PBS 2x100μLで洗浄します。
5. 上清を取り除き、PBS中の2% BSAと交換し、室温で1時間インキュベートしてブロッキングします。
6. 上清を取り除き、2% BSAで希釈した一次抗体100 μLをPBSにアプライし、室温で1時間、または4°Cで一晩インキュベートします。
   注:使用した一次抗体の濃度は 、材料の表に記載されています。指定のない限り、メーカーの推奨事項に従います。
7. 上清を取り除き、100 μLのPBS 3xで洗浄します。
8. 2% BSAで希釈した二次抗体100 μLをPBS溶液に適用し、室温で1時間、または4°Cで一晩インキュベートします。
   注:使用する一次抗体が蛍光プローブと標識されている場合は、この手順を省略できます。使用した二次抗体の濃度は 、材料表に記載されています。指定のない限り、メーカーの推奨事項に従います。
9. 上清を取り除き、100 μLのPBS 3xで洗浄します。
10. オプション:F-アクチンおよび核(DAPI)の対比染色では、PBSで両方のプローブを適切な希釈度(メーカーの推奨による)で混合して調製し、100 μLを適用し、室温で30分間インキュベートします。上清を取り除き、100 μLのPBS 3xで洗浄します。
11. 細胞培養インサートメンブレンはメスブレードで慎重に切り出し、マウント溶液でスライドガラスにマウントします。カバースリップを敷いて観察します。

ディスカッション

腸管の健康は、牛の生産性と全体的な健康の両方にとって最優先事項^です16。オルガノイド由来の2D単分子膜技術を活用することで、科学者は in vitro 環境内でウシ腸上皮の複雑な構造をより正確に模倣できるようになりました⁵。この革新的なアプローチは、多細胞系譜を含む腸内壁の多様な細胞組成を再現するだけでなく、粘液分泌や微絨毛の存在など、腸の生理学と病理を理解するために不可欠な主要な機能特性も捉えます³。回腸と直腸のセグメントに合わせた培養プロトコルの開発により、ウシの腸の健康を研究する能力を大幅に向上させる高度なプラットフォームが生まれました。この洗練されたアプローチにより、人獣共通感染症の病原体とウシの腸内環境との間の相互作用についての詳細な調査が可能になります。ウシの腸内生態系のユニークな側面を in vitro で密接に再現し、研究する能力は、家畜の健康を改善し、人獣共通感染症の蔓延を緩和するための的を絞った戦略の開発に向けた大きな前進です。

しかし、ウシ腸オルガノイドを用いた2次元単分子膜の開発を成功させるためには、オルガノイドとその解離した単一細胞の両方の健康と活力を維持することが重要です。慎重な取り扱いとストレスの最小化は、オルガノイドの効果的な増殖とその後の機能的な単分子膜の作製に不可欠な細胞の完全性と機能を維持するために最も重要です。さらに、均一な単分子膜を達成するには、大きな塊を形成せずにオルガノイドを単一細胞にうまく解離させることが必要です。このような凝集体は、細胞の分布を乱し、単分子膜の構造を損なう可能性があります。したがって、スムーズな解離のための精密な技術を採用することが重要であり、その結果、一貫した単一細胞懸濁液が得られます。さらに、細胞接着時や過剰な非接着性細胞を洗い流す際の障害を最小限に抑えることが有益になります。このアプローチは、3D形態形成の潜在的な問題に対処するために特に重要であり、単層の全体的な品質を向上させます。

生物学的起源のECMベースのハイドロゲルの注目すべき課題は、組成のバッチ間変動です¹⁷。これは、記載されているプロトコルや材料では観察されませんでしたが、ECM組成のバッチ間のばらつきは、単分子膜の開発を成功させるための課題となる可能性があります。ECM製品、ブランド、またはロット番号が変更されたことにより単層形成が損なわれる場合、細胞培養インサートのコーティングに必要な適切なECM濃度を決定するための最適化ステップが必要になることがあります。

さらに、変更を加える前に培地を室温に調整することは、熱衝撃を軽減し、細胞の健康を保護し、オルガノイド培養と単層培養の両方の品質を維持するのに役立つ重要なステップです。また、形成中およびその後のアッセイ中に単分子膜の完全性を維持するためには、穏やかな洗浄方法が最も重要であり、混乱を避けることで結果の不正確さを防ぐことができます。PBSをハンク平衡塩溶液(HBSS)に置き換えると、パラセル透過性アッセイなど、PBSへの反復洗浄または長時間の曝露中に問題となった単層の剥離を最小限に抑えるのに役立つと思われました。最後に、腸管のさまざまなセグメント(回腸や直腸など)の細胞の特定のニーズに合わせて培地を調整することは、 in vivo 条件を正確に再現するために不可欠です。この特異性により、最適な細胞の健康と機能が確保され、牛の腸の生理機能や病原体との相互作用の正確なモデリングが容易になり、オルガノイド研究におけるこれらの重要なステップが浮き彫りになります。

細胞の取り扱いを丁寧に行うだけでなく、細胞計数とTEER測定に関連する優れた技術的能力を構築することは、機能する2D単分子膜の開発を成功させるために重要です。細胞の過大カウントまたは過少カウントに起因する播種密度が低すぎる場合と高すぎる場合、それぞれ単層の成長が損なわれる可能性があります。細胞数を慎重に検討し、不正確な播種密度が疑われる場合は適切な播種密度を確保することをお勧めします。さらに、TEER測定技術が不十分な場合、電極に不注意な傷が付くことで単層が破壊される可能性があります。電極を頂端チャンバーに慎重に導入し、膜表面に対する垂直方向を維持することに特に注意を払うことで、単分子膜への偶発的な損傷のリスクを軽減できる可能性があります。

ここに記載されている傍細胞透過性アッセイの方法は、以前のプロトコル¹⁸から適応されています。報告されたプロトコルの変更には、120 分を超える複数のサンプリングや、サンプリングされたアリコートを等量の PBS に置き換えることが含まれ、結果の精度と信頼性を向上させるために行われます。チャンバー内の総容積を維持することは、浸透圧バランスの維持、細胞の完全性の確保、正確な透過性評価に不可欠な濃度勾配の維持、輸送速度に影響を与える可能性のある静水圧の変化の防止など、いくつかの理由で重要です。サンプリングされた蛍光トレーサー含有PBSの量と同等の新鮮なPBSを基底外側チャンバーに補充するこの方法は、これらの条件を維持し、単層透過性の正確で有意義な評価を可能にするために極めて重要です。傍細胞透過性アッセイは、単層を通るトレーサー分子の動きを直接評価することにより、TEER測定を補完する役割を果たします。さらに、様々な実験室間でTEER値を比較することは、関連する洞察をもたらさないかもしれない、なぜなら、これらの値は、温度や細胞が培養される特定の条件、例えば細胞タイプ、継代数、および培養培地の組成など、多数の変数によって影響を受ける可能性があるからである¹⁹。パラセルラー透過性アッセイは、上皮バリア²⁰内の接着体およびタイトジャンクションの効果的な発現の機能的なin vitro評価を提供する。

3Dオルガノイドから2D単分子膜の開発は、培養技術の大きな進歩を表していますが、2D単分子膜に関連する制限を認識することが重要です。大きな欠点の1つは、これが静的な培養システムのままであり、 in vivo 環境で見られる動的な刺激を欠いていることです。さらに、培養システム内の酸素含有量の変更は、蓋付きの培養プレートを含むオープンセットアップのため、嫌気性細菌との長期共培養には適していないため、課題があります。これらの制限は、より制御された生理学的に関連性のある環境を提供するマイクロ流体システム²¹のような、よりダイナミックな培養プラットフォームを採用することによって対処できる可能性がある。さらに、現在の培養条件は幹細胞の成長維持に有益な栄養素が豊富である一方で、上皮細胞の生理的分化を誘導するには最適ではない可能性があることを認識することが重要です。この不一致は、 in vivo 条件を厳密に模倣し、分化プロセスをサポートするために、将来の研究で最適化する必要性を浮き彫りにしています。これらの制限に対処し、これらのアプローチを洗練させることで、オルガノイド培養技術の有用性と適用性が向上し、 in vitroでの消化管の複雑なダイナミクスと相互作用の再現に近づきます。

ウシの回腸組織および直腸組織から2D単分子膜を生成するためのプロトコルは、研究者に小腸上皮と大腸上皮の両方の管腔界面の貴重なin vitroモデルを提供します。このモデルは、基本的な動物栄養学研究、特にさまざまな条件下で栄養素がどのように吸収されるかを調べるための応用に、大きな可能性を開きます。注目すべき関心領域は、リーキーガット症候群の調査であり、しばしば食事の変化と極端な環境温度によって引き起こされる胃腸透過性の異常な増加を特徴とする^22,23。さらに、このモデルは、腸内細菌叢とその宿主との間の複雑な相互作用を調査するための重要なツールとして機能します。これにより、共生微生物が宿主生物の健康にどのように影響するかを研究することができ、獣医学および医学の重要な側面に取り組んでいます^1,24。さらに、ヒトの食品媒介性病原体は、牛^の腸^8,9,25の異なるセグメントで共生として頻繁に発見され、このプロトコルは、これらの人獣共通感染症の病原体がそれぞれのニッチで繁栄することを可能にする特定の条件の詳細な研究を可能にします。

この研究を通じて、直腸オルガノイド由来モノローヤと回腸オルガノイド由来の単分子膜は、開発を成功させるために異なる条件が必要であることが観察されました。具体的には、直腸オルガノイド由来の単分子膜を、基礎培地中の2% ECMベースのハイドロゲルで調製した細胞培養インサートに最初に播種したところ、大きな穴と細胞の脱落が認められました。この問題は、特殊な直腸単分子膜培地に切り替え、インキュベーション期間を播種前の一晩に延長することで解決されましたが、回腸オルガノイド由来の単分子膜は、より短い調製プロトコルを使用して開発に成功しました。さらに、培地へのCHIR99021の添加は、直腸単分子膜²⁶ の確立を一貫して改善したが、回腸単分子膜²⁷には必要ではなかった。さらに、回腸単層は、直腸オルガノイドと比較して、開発を成功させるためにより高い細胞密度を必要としました²⁷。これらの最適化された条件(表1)は、耐性バリアの完全性を維持する単分子膜を繰り返し開発しており、特定の腸セグメントに合わせて培養条件を調整することの重要性を強調しています。

これらの研究には、 in vivo 腸の多細胞系譜の複雑さを正確に反映するモデルへのアクセスが重要です。これにより、研究者は腸環境の自然条件を厳密に模倣することができ、実験のより信頼性の高い基盤を提供することができます。このプロトコルにより、研究者は研究能力を強化する堅牢なモデルを装備し、研究分野での画期的な発見につながる可能性があります。このアプローチは、腸の健康と病気の理解に貢献するだけでなく、家畜管理と食品の安全性を改善するための戦略の開発にも役立ちます。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Basal Medium
Advanced DMEM/F12 (1X)	Gibco	12634-010	n/a
GlutaMAX-I (100X)	Gibco	35050-061	2 mM
HEPES (1M)	Gibco	15630-080	10 mM
Pen Strep Glutamine (100X)	Gibco	10378-016	1X
Organoid Culture Medium (Supplements to Basal Medium)
A-83-01	Sigma-Aldrich	SML0788-5MG	500 nM
B27 Supplement (50X)	Gibco	17504-001	1X
[Leu15]-Gastrin I human	Sigma-Aldrich	G9145-.5MG	10 nM
Murine EGF	PeproTech	315-09-500UG	50 ng/mL
Murine Wnt-3a	PeproTech	315-20-10UG	100 ng/mL
N-Acetyl-L-cysteine	MP Biomedicals	194603	1 mM
N-2 MAX Media Supplement (100X)	R&D Systems	AR009	1X
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636-100G	10 mM
Noggin Conditioned Medium	n/a	n/a	10 vol/vol %
Primocin	InvivoGen	ant-pm-2	100 µg/mL
R-Spondin-1 Conditioned Medium	n/a	n/a	20 vol/vol %
SB202190	Sigma-Aldrich	S7067-25MG	10 µM
Monolayer Culture Medium (Supplements to Organoid Culture Medium)
CHIR99021	Sigma-Aldrich	SML1046-5MG	2.5 µM
HI FBS	Gibco	10438-034	20 vol/vol %
LY2157299	Sigma-Aldrich	SML2851-5MG	500 nM
Y-27632	StemCellTechnologies	72308	10 µM
Reagents
Alexa Fluor 488 Mouse anti-E-cadherin	BD Biosciences	560061	1:200 dilution
Alexa Fluor 647 Phalloidin	Invitrogen	A22287	1:400 dilution
BSA	Cytiva	SH30574.02	2 w/vol %
Cell Recovery Solution	Corning	354253	n/a
DAPI Solution (1 mg/mL)	Thermo Scientific	62248	1:1000 dilution
DPBS (1X)	Gibco	14190-144	n/a
Fluorescein Isothiocyanate–Dextran	Sigma-Aldrich	FD4-100MG	0.5 mg/mL
Matrigel Matrix	Corning	354234	n/a
Paraformaldehyde Solution (4%)	Thermo Scientific	J19943K2	n/a
ProLong Gold antifade reagent	Invitrogen	P36930	n/a
SNA, EBL, Fluorescein	Vector Laboratories	FL-1301	1:100 dilution
Triton X-100	Thermo Scientific	A16046.AE	0.3 vol/vol %
TrypLE Express	Gibco	12605-028	n/a
Trypan Blue Solution, 0.4%	VWR Life Science	K940-100ML	n/a
Materials and Equipment
0.4 µm Cell Culture Insert	Falcon	353095
24-well Cell Culture Plate	Corning	3524
48-well Cell Culture Plate	Thermo Scientific	150687
70 µm Sterile Cell Strainer	Fisher Scientific	22-363-548
96-well Cell Culture Plate	Greiner Bio-One	655086
Centrifuge	Eppendorf	5910Ri
CO2 Incubator	Thermo Scientific	370
Epithelial Volt-Ohm Meter	Millipore	Millicell ERS-2
Hemocytometer	LW Scientific	CTL-HEMM-GLDR
Inverted Confocal Microscope	Leica Microsystems	SP8-X
Inverted Phase-Contrast Microscope	Leica Microsystems	DMi1
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12-540-B
Microplate Reader	Molecular Devices	SpecrtraMax i3x
Microscope Slides	Fisher Scientific	22-034-486
Pasteur Pipets	Fisher Scientific	13-678-20C
Scalpel Blade	iMed Scientific	-	#11 carbon steel
Vortex Mixer	Scientific Industries	SI-0236
Software
LAS X imaging software	Leica Microsystems	LAS X 3.7.6.25997
Microplate Reader software	Molecular Devces	SoftMax Pro 7.1.2