無傷の ショウジョウバエ 幼虫のレーザー細胞アブレーションにより、シナプスの競合が明らかになる

要約

このプロトコルは、無傷の ショウジョウバエ の幼虫の個々のニューロンのレーザー細胞アブレーションを示しています。この方法により、発達中の神経系におけるニューロン間の競争を減らす効果の研究が可能になります。

要約

このプロトコルは、無傷の ショウジョウバエ メラノガスター 幼虫の中枢神経系 (CNS) における 2 光子レーザー システムによる単一ニューロン アブレーションについて説明しています。この非侵襲的な方法を用いて、発生中の神経系を細胞特異的に操作することができる。ネットワーク内の個々のニューロンの発達を阻害することで、神経系がシナプス入力の喪失をどのように補うことができるかを研究することができます。 ショウジョウバエの巨大線維系では、シナプス前巨線維(GF)とシナプス後大転子運動ニューロン(TTMn)の2つのニューロンに焦点を当てて、個々のニューロンが特異的にアブレーションされました。GFは同側のTTMnとシナプスを形成し、これはエスケープ応答に重要です。GFが軸索成長を開始した直後に、第^{3インスター} 脳のGFの1つを切除すると、CNSの発達中に細胞が永久に除去されます。残りのGFは不在の隣人に反応し、反対側のTTMnに対して異所性シナプス終末を形成します。この非定型の両側対称末端は、色素結合によって実証されるように両方のTTMnsを神経支配し、電気生理学的アッセイによって実証されるように両方の運動ニューロンを駆動します。要約すると、単一の介在ニューロンのアブレーションは、片側のニューロンの喪失を補い、エスケープ回路に対する正常な応答を回復できる両側のニューロンのペア間のシナプス競争を示しています。

概要

レーザーアブレーションは、さまざまな生物の神経回路を解剖するための好ましいツールです。ミミズやハエなどのモデル遺伝システムで開発され、神経系の構造、機能、および発達を研究するために動物界全体に適用されています^1,2,3。ここでは、ショウジョウバエの回路組み立て中にニューロンがどのように相互作用するかを調べるために、単一ニューロンアブレーションが使用されました。ハエの脱出システムは、成虫のハエで最大のニューロンと最大のシナプスを含んでおり、その回路は過去数十年で十分に特徴付けられてきたため、分析のお気に入りの回路^です4。ジャイアントファイバー回路の組み立てにおいてニューロン間相互作用が果たす役割は、この研究の焦点です。

1960年代のヒューベルとヴィーゼルの研究以来、神経科学で焦点となってきた相互作用の1つのタイプは、「シナプス競争」^5,6です。このプロトコルでは、レーザーアブレーションを使用して、ショウジョウバエの巨大繊維系(GFS)における単一細胞アブレーションによる競争の役割を再検討し、現....

プロトコル

議定書に使用されたすべての動物は、 ショウジョウバエ・メラノガスターの種でした。本種の使用にまつわる倫理的な問題はありません。この作業を実行するために倫理的なクリアランスは必要ありませんでした。本研究で使用した ショウジョウバエ の種、試薬、機器の詳細は、 資料表に記載されています。

1. ショウジョウバエ の繁殖と正しい幼虫期の選択

1. アブレーションする細胞内の発現を駆動するGal4ドライバーラインを選択し、UAS-GFPレポーターラインと再結合または交差させます。25°Cの標準的なフライフードでフライを育てます。
   注:ジャイアントファイバー(GF)アブレーションの場合、R91H05-Gal4またはA307-Gal4をUAS-GFPと再結合しました。ShakB(致死)-GAL4をUAS-GFPと再結合させてTTMnアブレーションに使用しました( 材料の表を参照)。
2. 食物から出始め、食物バイアルの側面を這い上がる幼虫を選択します。これらの幼虫は、GF細胞アブレーションを行うのに適した段階である放浪段階にあります。
   注:アブレーションは、どの幼虫の段階でも行うことができます。GF細胞体は脳内で容易に同定できるため、GFSの発達を操作するためには最後の幼虫期が重要であったが、こ....

ディスカッション

2光子顕微鏡による細胞アブレーションは、 ショウジョウバエの神経回路発達を操作するための非常に成功した方法であることが証明されました。この方法は非侵襲的であるため、動物へのダメージは最小限に抑えられます。このデータは、既知の回路のこの細胞特異的な操作の有用性を裏付けています。

アブレーションを成功させるために重要だったのは、最も.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jaxkson ImmunoResearch	111-545-003
Anti-green fluorescent protein, rabbit	Fisher Scientific	A11122	1:500 concentration
Apo LWD 25x/1.10W Objective	Nikon	MRD77220	water immersion long working distance
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	B4287-25G
Chameleon Ti:Sapphire Vision II Laser	Coherent
Cotton Ball	Genesee Scientific	51-101
Dextra, Tetramethylrhodamine, 10,000 MW, Lysine Fixable (fluoro-Ruby)	Fisher Scientific	D1817
Drosophila saline			recipe from Gu and O'Dowd, 2006
Ethyl Ether	Fisher Scientific	E134-1	Danger, Flammable liquid
Fly food B (Bloomington recipe)	LabExpress	7001-NV
Methyl salicylate	Fisher Scientific	O3695-500
Microcentrifuge tube 1.5 mL	Eppendorf	22363204
Microscope cover-slip 18x18 #1.5	Fisher Scientific	12-541A
Neurobiotin Tracer	Vector Laboratories	SP-1120
Nikon A1R multi-photon microscope	Nikon		on an upright FN1 microsope stand
NIS Elements Advanced Research	Nikon		Acquisition and data analysis software
Paraformaldehyde (PFA)	Fisher Scientific	T353-500
PBS (Phosphate Buffered Salin)	Fisher BioReagents	BP2944-100	Tablets
R91H05-Gal4	Bloomington Drosophila Stock Center	40594
shakB(lethal)-GAl4	Bloomington Drosophila Stock Center	51633
Superfrost microscope glass slide	Fisher Scientific	12-550-143
Triton X-100	Fisher Scientific	422355000	detergent solution
UAS-10xGFP	Bloomington Drosophila Stock Center	32185