げっ歯類の心臓組織からの堅牢なミトコンドリア単離

要約

ミトコンドリアの生体エネルギーおよびメタボローム研究により、多くの疾患におけるミトコンドリアの多面的な役割が明らかになっていますが、これらのオルガネラの単離方法はさまざまです。ここで詳述する方法は、複数の組織源から高品質のミトコンドリアを精製することができます。品質は、高解像度呼吸測定で評価される呼吸制御比やその他の指標によって決定されます。

要約

ミトコンドリアの単離は、分子生物学と生化学の分野のパイオニアが代謝障害や疾患を研究するために確立した手順に従って、何十年にもわたって行われてきました。ミトコンドリアの生理学と生体エネルギー学を適切に調査するには、一貫したミトコンドリアの品質が必要です。しかし、研究者は多くの異なる分離方法が公開されています。実験戦略が異なれば必要な単離方法も異なりますが、基本的な原理と手順は似ています。このプロトコールは、小動物や細胞を含む様々な組織源からよく結合したミトコンドリアを抽出することができる方法を詳述しています。概説されているステップには、臓器解剖、ミトコンドリア精製、タンパク質定量、およびさまざまな品質管理チェックが含まれます。高品質のミトコンドリアを特定するために使用される主要な品質管理指標は、呼吸制御比(RCR)です。RCRは、酸化的リン酸化中の呼吸数とADPがない場合の呼吸数との比です。代替メトリックについて説明します。このプロトコルでは、組織源に対する高いRCR値が得られますが、研究者の個々のニーズに合わせていくつかのステップを最適化することができます。この手順は堅牢であり、動物モデルと組織供給源全体で平均以上のRCR値を持つミトコンドリアを一貫して分離しました。

概要

ミトコンドリアは、特定の細胞機能に最適化された細胞質エネルギー条件を確立する細胞内小器官です。細胞、組織、生物レベルの研究は、ミトコンドリアの機能に関する洞察を提供することができますが、オルガネラを単離することで、他の方法では不可能なレベルの実験的制御が可能になります。ミトコンドリアの単離は1940年代から行われており、さまざまな細胞や組織にわたる代謝と呼吸の機構的研究を可能にしています^1,2。ミトコンドリアの歴史的関連性も十分に文書化されています³。ATPの主な産生者として、ミトコンドリアは細胞および臓器の最適な機能に不可欠な多くの重要な役割を果たしています⁴。ミトコンドリアマトリックス内では、基質はTCAサイクルによって酸化され、還元当量やNADHやUQH_などの可動電子キャリアが生成されます2 ^5,6。シトクロムCは、ミトコンドリアの生化学反応ネットワーク⁷における3番目の主要な移動電子キャリアである。これらの分子は、ミトコンドリア内膜

プロトコル

すべての脊椎動物の使用と治療は、ミシガン州立大学の動物管理および使用委員会(IACUC)によって審査され、承認されたプロトコルに従って行われました。このプロトコルは、雄と雌の両方のハートレーアルビノモルモットとスプレイグドーリー(SD)ラットを使用して設計されました。モルモットからの心臓ミトコンドリアの単離のために、動物を4〜6週齢(300〜450g)で犠牲にした。雌雄のSDラットからの心臓ミトコンドリアは、10〜13週齢(250〜400g)で得られた。バッファーのレシピは 表1 に記載されており、事前に準備する必要があります。本試験で使用した試薬および装置の詳細は、 資料表に記載されています。

1. 実験の準備

1. 単離を開始する前に、2本の50 mL遠心分離チューブに「Spins 1 and 2」および「Spin 3」とラベル付けします。
2. チューブ、解凍したばかりの分離バッファー(IB)、鋭利なミンチハサミ、組み立てた均質化プローブ、および5 mLのビーカーまたは同等のサイズの容器を氷の上に置きます。
3. 解凍したばかりの呼吸緩衝液(RB)をインキュベーターに入れ、その後の呼吸器アッセイのために温めます。
4. 冷蔵遠心分離機を4°Cに予冷....

ディスカッション

このプロトコルに簡潔に記載されている方法に従うことで、他の組織タイプや供給源に加えて、小さなげっ歯類の心臓組織からよく結合したミトコンドリアを確実に単離することができます。全体として、このプロセスには合計3〜3.5時間かかり、その間、すべての動物組織、サンプル、および分離株は、劣化を制限するために可能な限り4°Cの氷上に留まる必要があ?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL microcentrifuge tubes
10 mL glass beaker			For organ disection and mincing
50 mL centrifuge tubes			Centrifugation
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate	Sigma	A5285	Respirometry assays
BSA Protein Assay Kit	Thermo Scentific	PI23225	Mitochondrial protein quantification
Dextrose	Sigma	DX0145	For buffer (CB)
Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid	Sigma	E4378	For buffers (CB and IB) and respirometry assays
Glass cannula	Radnoti		Guinea pig and rat heart perfusion
Heparin sodium porcine mucosa	Sigma	SRE0027-250KU	Animal IP injection
High-resolution respirometer			Clark-type electrode; oxygraph with 2 mL chambers
Induction chamber
Isoflurane	Sigma	792632	Anesthetic
L-malic acid	Sigma	02288-50G	Respirometry assays
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma	M9272	For buffer (RB)
Mannitol	Sigma	MX0214	For buffer (IB)
Microliter syringes			Sizes ranging from 5–50 µL
Microplate reader			Must be able to incubate at 37 °C
MOPS	Sigma	475898	For all buffers
O2 tank
OMNI THQ Homogenizer	OMNI International	12-500	Similar rotor stator homogenizers will work
pipettes			Volumes of  2–20 µL; 20–200 µL; 200–1000 µL
Potassium chloride	Sigma	P3911	For buffers (RB and CB)
Potassium phosphate dibasic	Sigma	795496	For buffers (IB and RB)
Protease from Bacillus licheniformis	Sigma	P5459
Sodium chloride	Sigma	S9888	For buffer (CB)
Sodium pyruvate	Fisher bioreagents	BP356-100	Respirometry assays
Sucrose	Sigma	8510-OP	For buffer (IB)
Surgical dissection kit			Depends on animal and tissue source
Tabletop centrifuge			Must cool to 4 °C