腫瘍低酸素症の評価:電子常磁性共鳴によるin vivo 3D酸素イメージング

要約

マウス腫瘍の定量的3D酸素マップは、パルス電子常磁性共鳴を使用して非侵襲的に画像化されました。超音波Bモードとパワードップラーは、解剖学と血管構造に使用されました。両方のモダリティからの画像を重ね合わせることで、マルチパラメトリック腫瘍解析が可能になりました。

要約

酸素分圧(pO₂)の正確かつリアルタイムの測定は、がんを含む多くの病状に貴重な情報をもたらします。腫瘍pO₂ が低い(すなわち、低酸素症)は、腫瘍の攻撃性と治療に対する反応の低下に関連しています。腫瘍pO₂ の定量化により、治療効果の評価が可能になります。電子常磁性共鳴画像法(EPRI)、特にパルスEPRIは、 in vivoで組織の酸素化を評価する高度な3次元(3D)方法として登場しました。この革新は、ESR(電子常磁性共鳴)の技術開発と、トリアリールファミリーの水溶性酸素濃度スピンプローブの適用によって可能になり、高速で高感度な酸素化データを提供します。スピンプローブ(T1および/またはT2)の緩和時間は、選択したボクセル中のpO₂ に関する正確な情報を提供します。

ヒト膠芽腫LN229腫瘍は、BALB/cヌードマウスの肩甲骨間流行パッドで増殖した。超音波(US)イメージングは、腫瘍の解剖学的情報の参照として使用されました。組織pO₂をイメージングするために、動物をフィデューシャルを使用して動物床の固定位置に置き、イメージングモダリティ間の登録を可能にしました。OX071造影剤を投与した後、EPRIを実施し、続いてUS Bモードを実施しました。スピンプローブの毒性が低いため、腫瘍の成長や治療中にこの手順を繰り返すことができます。イメージングに続いて、登録プロセスはMATLABで記述されたソフトウェアを使用して実行されました。最終的に、特定の腫瘍について低酸素画分を計算することができ、pO₂ 組織分布のヒストグラムを経時的に比較することができます。超音波と組み合わせたEPRIは、前臨床環境での腫瘍の酸素マッピングのための優れたツールです。

概要

複雑で空間的で動的な相互作用を持つ腫瘍微小環境(TME)を理解することで、腫瘍生物学をより深く理解することができます。低酸素症、または低酸素レベルは、TMEの主要な要素であり、心血管疾患、糖尿病などの代謝障害、慢性腎臓病など、他の生命を脅かす状態の発症に重要な役割を果たします^1,2,3。組織の酸素化は基本的な要素であり、特に癌の状況では、部分組織酸素圧(pO₂)が治療抵抗性と相関しています。pO₂ レベルが 10 mm Hg を超えると、低線形エネルギー移動 (LET) 放射線療法 (酸素増強効果) の有効性が増加します。

電子常磁性共鳴画像法(EPRI)を使用した最近の研究では、酸素ガイド下放射線療法により、マウスモデルのさまざまながんの生存率が2倍に改善されることが実証されています^4,5。これは、腫瘍のpO₂が複数のエッペンドルフ電極測定で測定され、pO₂の中央値または平均値が10 torr⁶未満であることが判明したヒト被験者と似ています。放射線療法以外にも、腫瘍の低酸素症は、腫瘍の攻撃性や免疫療法などの他の治療法の結果と直接相関しています^7,8。この関連性は、治療結果を向上させ、疾患の病態生理学を理解する上での正確な酸素測定の重要性を強調しています。

最適な in vivo 酸素濃度測定には、組織灌流やヘモグロビン飽和度などの要因に依存しない、組織部分の酸素圧を直接測定する必要があります。この手順は非侵襲的であり、長時間の麻酔、組織温度の変化、組織圧力とpHの大幅な変化など、生物への潜在的な影響を避けるために、短時間で正確なイメージング時間が必要です。組織酸素濃度計は、高い精度と信頼性を示し、pHや酸化還元状態の違いなど、組織微小環境の変動に関係なく一貫した測定を保証する必要があります。効果的な治療計画のためには、リアルタイムの画像データ再構成と簡単な解釈が重要です。これには、できれば1mm未満の空間分解能を達成するだけでなく、サイクリング低酸素症などの組織酸素状態の動的変化を監視するための高速データ収集を可能にすることも含まれます。

このような状況の中で、分子状酸素の測定や低酸素症の評価のためのさまざまな技術が開発されており、それぞれに独自の適用性と利点があります。白金電極は、細胞および生体動物の組織酸素濃度測定の「ゴールドスタンダード」と考えられており、組織への正確な挿入を通じて一貫した測定を提供します。蛍光プローブを用いた光学的方法、光音響法、遺伝子発現やタンパク質発現による低酸素症の影響のモニタリング、コメットアッセイなど、他のアプローチも使いやすいですが、組織内の光路によって間接的または制限されます。低酸素症および/または酸素化を評価するための有望な代替手段は、磁気共鳴画像法(MRI)-OE-MRI¹⁰またはMOBILE¹¹、さまざまな低酸素感受性プローブ12を用いた陽電子放出断層撮影法(PET)¹²、または電子常磁性共鳴(EPR)であるように思われる。

EPRは、生物医学の分野で長い歴史を持っています。この現象自体は1944年に初めて報告され、化学構造解析のツールとして、また最近では、不対電子を持つ生体システムや材料として広く採用されました¹³。ESR分光法は、光合成、金属タンパク質、ラジカル酵素、リン脂質膜などの生物学的システムのダイナミクスと構造を研究するために使用されてきました14,15,16。電子常磁性共鳴(EPR)分光法と断層撮影法は、腫瘍の酸素化と微小環境を研究するための極めて重要な非侵襲的方法として浮上しており、空間分解能は~1 mm、時間分解能は1〜10分、pO₂分解能は1〜3 torr ^5,17,18です。

連続波(CW)ESR法は、スペクトルの記録と解釈が簡単なため、ほとんどのアプリケーションで広く使用されています。酸素とスピンプローブの相互作用は、ESRシグナル強度または線形状の変化を評価することで機能し、サンプル内の酸素レベルに関する洞察を提供します。CW ESRは、パルス法と比較して、より広い範囲のpO₂に対する感度において顕著な利点があります。種々のパルス配列を応用することで、電子スピン-スピン緩和時間、スピン格子緩和時間、隣接スピンとの相互作用などの情報を解明することができる^18,19。電子スピンエコー(IRESE)読み出しによる反転回復などのパルスESR技術は、スピン格子緩和速度を測定し、低酸素濃度^19,20でのスピンプローブ-スピンプローブの緩和によって引き起こされる緩和からのアーチファクトを回避します。ESRは、酸素濃度の変化を高い時間分解能と空間分解能で監視するために使用できます。しかし、高酸素濃度の酸素濃度測定では、電子スピンエコー(ESE)で測定された横磁化の緩和時間が短いため、パルスESRは限界に直面します。結局のところ、CWとパルスESRは相補的であり、スピンシステムを確実に理解するためには、両方の方法を適用する必要があります。

ESR酸素濃度測定技術は、酸素レベルとスピン格子との間の線形関係、および溶液中のスピンスピン緩和速度に依存しています。すべての酸素濃度プローブは、多くの場合、可溶性スピンプローブと微粒子スピンプローブの2つのタイプに分けられます。正しいスピンプローブの選択は、実験のセットアップと必要な情報によって異なります21,22,23。ニトロキシドなどの可溶性スピンプローブ、またはOX063およびその重水素化型OX071などのトリチル誘導体^24,25は、組織全体に分布しており、全ボリュームからの情報を提供します。あるいは、シングルポイント測定、および長期および反復的な酸素評価には、LiPc、LiBuO、または炭素誘導体などの固体プローブを使用できます(表1を参照)22,23,26。

超音波検査 Bモードイメージングは、軟部組織イメージングのためにクリニックで広く使用されています。分解能は使用するトランスデューサーの周波数によって異なり、前臨床試験では、18 MHz以上で平面内と画像の深さに十分な解像度が得られます。超音波検査のさらなる利点は、パワードップラーモードを使用して機能的な血管系画像を取得できることです。ここでは、生きたマウスの腫瘍の3D酸素マップを生成する方法として、電子常磁性共鳴酸素イメージング法(EPROI)を紹介します。対応する超音波検査により、EPROI内の腫瘍定義に必要な解剖学的参照が可能になります。すべての動物に対して複数のイメージングセッションが可能です。最後のステップは、腫瘍体積から pO₂ ヒストグラムを取得するためのモダリティ間の画像再構成とレジストレーションを含む分析です。

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プロトコル

マウスは承認された動物飼育施設から入手し、すべての実験は倫理ガイドライン(私たちの場合 - 許可番号165/2023、ポーランド、クラクフの第一地方倫理委員会)に準拠して行われました。

1. 動物および腫瘍ライン

注:マウスは、標準的な実験室条件下で飼育されました:明暗:12時間/12時間、湿度:60%、温度:23°C。 彼らには、コミュニティケージ内の飲料水を無料で利用できる標準的なチャウダイエットが提供されました。

1. マウス膠芽腫多形性LN229細胞株培養
   1. LN229細胞を25 cm² 組織培養フラスコで、10%熱不活化ウシ胎児血清(FBS)およびペニシリン-ストレプトマイシンをそれぞれ10 U/mLおよび0.1 mg/mLの濃度で添加したDMEM培地で培養します。
   2. 5%_CO2 を含む加湿雰囲気で細胞を37°Cで維持し、マグネシウムイオンとカルシウムイオンを含まない0.25%トリプシン-EDTAとPBS(pH 7.4)を使用して48時間ごとに継代します。
2. 腫瘍接種
   1. 接種の1週間前に、マウスを毎日扱い、研究者に慣れ親しんでください。
   2. 接種当日は、マウスの体重を量ります。
   3. 200,000個のLN229細胞を成長因子を含まない50 μLの細胞外マトリックスに懸濁します。29 Gの針を使用して、細胞混合物を16週齢のBALB / cヌードマウス(N = 5)の肩甲骨内脂肪パッドに皮下接種します。

2.ドップラーUSイメージング

腫瘍イメージングの全体的なタイムラインを 図1に示します。超音波イメージングは、EDROIの直前の参照として、ドップラーUSとアナトミーUSによる血管系イメージングの両方に使用されます(図2)。Bモード解剖学的イメージングは、ESRによる腫瘍の酸素化分析に不可欠であり、セクション3で説明します。ドップラー超音波画像検査(セクション2)は、登録を成功させるために必須ではありませんが、それでもEPR研究の最適な時間枠に関する貴重な情報を提供し、腫瘍領域の活動性血管系の決定を可能にします。

1. マウスの準備
   1. 腫瘍が約30^{mmに達する}まで待ちます3。必要に応じて、腫瘍部位の周りのマウスを手動で剃ります。
   2. 2%イソフルランを使用して麻酔を誘発し、1〜1.5%イソフルランで維持します。
   3. 動物を麻酔室から加熱パッドに移し、準備中に体温を37°Cに維持します(直腸温プローブに基づく)。動物の体温を安定させて、適切な生理学的パラメータフィードバックを取得します。
2. 超音波 検査
   1. 前臨床イメージングには 、57-25 MHzトランスデューサ ーを備えた超音波システムを使用します(図2、ステップ1)。
   2. 3D Bモード測定値を取得し、矢状方向の腫瘍形態を可視化します。 0.1mm刻みのサイズを使用してください。
      注意: まったく同じ設定を維持するために、動物やトランスデューサーを動かさないでください。
   3. パワードップラーモードを使用して、次のパラメータで機能的な腫瘍血管系を視覚化します:速度:1.5 kHz、壁フィルター:低、優先度:75%、持続性:中、ステップサイズ0.10 mm。
   4. トランスデューサーを回転させて、手順2.2.2と2.2.3を軸方向に繰り返します。
   5. 超音波メーカーが提供するソフトウェアでデータ分析を行います。腫瘍の境界をマークし、3D画像にアップロードして、腫瘍の体積と血管系の割合を計算します。

3. エプロイ

1. プローブの準備
   1. -80°Cで保存したOX071粉末を注射用H₂Oに溶解し、最終濃度1 g/10 mL(~70 mM)にします。
2. マウスの準備
   1. 室内の空気と混合した1%〜3%のイソフルランでマウスを麻酔し、動物ホルダーの上に置きます。
   2. 適切な水分補給レベルを維持するために、生理食塩水1mLを皮下投与します。.
   3. マウスの皮膚に取り付けられた呼吸枕センサーと表面温度計を使用して、動物の呼吸数(80 ± 20 BPM)と体温(37 ± 1°C)をモニターします。直腸温を基準点として監視します(37°C±1°C)。
   4. ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)チューブ(外径0.7 mm)を腹腔内に挿入して、スピンプローブを投与します。ビニルポリシロキサン(VPS)を使用してカニューレを固定し、腹腔から脱落しないようにします。
   5. 尿カテーテル(24G)を挿入し、排泄されたスピンプローブを採取します。
   6. VPS歯科用粘土を使用してマウスを動物用ベッドに固定し、固定します(図2A)。
3. 登録のための解剖学的米国イメージング
   1. 3D制御テーブルとレベルベッドの電源を入れます。プラスチック製のベッドホルダーで隔離された動物の温度が37°Cに維持されるように、プラットフォームの温度を60°Cに設定します。
   2. 固定された動物をベッドホルダーに動物用ベッドを置き、ESR測定の前に解剖学的イメージングのために3D制御テーブルに移します(図2B)。動物がベッドホルダー内に固定され、暖房プラットフォームに触れていないことを確認してください。
   3. ベッドホルダーの位置を3次元に固定して、回転、特に正確な登録に不可欠なXZ(矢状面)回転を防ぎます。
   4. ポジションマーカー(テープ上の釣り針、直径0.35mm)をベッドホルダーに置き、共振器の始まりをマークします。
   5. Bモードイメージングは、Y軸に向かって軸方向と矢状方向の両方に1mmステップで手動で行います。
   6. 特定のトランスデューサー周波数に依存する次のパラメーターで腫瘍構造を画像化します。18 MHzトランスデューサの場合、深さ20 mm、ダイナミックレンジ84 dB、出力8 dB、ゲイン80%。40 MHzトランスデューサの場合、深さ20 mm、ダイナミックレンジ32 dB、ゲイン100%。57 MHzトランスデューサの場合、深さ13 mm、ゲイン6 dB、電力100%。特定の腫瘍の位置に応じてトランスデューサーの焦点の設定を調整します。
   7. 解剖学的イメージングの最後に、マウスから余分なゲルを拭き取り、動物ベッドに固定されたマウスをベッドホルダーから取り出します。
4. ESR酸素イメージング
   1. パルスESR用の酸素イメージャを利用し、685MHzから735MHzの範囲の無線周波数で動作します。セットアップには、オフセットコイルを使用して3Dイメージングと緩和時間の解析を行います。32 mm x 35 mサイズの水平共振器を使用してください。
   2. 解剖学的超音波検査の後、動物床に固定されたマウスを速やかにESRイメージャーに移します(図2C)。セクション3.3で概説されている手順と同様に、共振器内の回転を最小限に抑えるために、動物用ベッドの位置を慎重に維持します。
   3. 温度プローブを再接続して、動物の体温を継続的に監視および維持し、共振器内の温度と相関させます。
   4. ESR分光器ソフトウェアで、チューニングホイールを使用して周波数を約725MHzの中心にすることで、共振器のチューニングを行います(図3A)。
      注意: よく一致した共振器は、25dB以上のディップを持つ必要があります。
   5. 減衰値を20dBから3dBに調整して、マイクロ波電力を最適化して60ns(図3B)でピークを取得します。
   6. 動物床内に配置された基準の自由誘導減衰(FID)が磁場の中心にあり、段階的になるように装置を調整します(図3C)。
   7. 前に挿入したカニューレを介して100μLのOXO71を腹腔内に投与し、続いて50〜100μLの生理食塩水でフラッシュします。
   8. プログラムされたキューシーケンスを使用して、設定されたパラメータで測定値を取得します。一般的なシーケンスには、T1、T2の緩和時間、基準画像用の3D電子スピンエコー(ESE)、動物画像用の4D逆転回復電子スピンエコー(IRESE)が含まれます。1.5 G/cm グラジエント、繰り返し時間 55 μs、プレトリガー -250 ns、t90 は 60 ns、タウ 400 ns で IRESE イメージングを収集します。合計取得時間 ~12分プローブ注入後、少なくとも30〜40分(3〜4倍)IRESEイメージングを繰り返します。
   9. イメージング後、マウスを動物用ベッドから加熱パッドに移します。適切な水分補給レベルを維持するために、生理食塩水1mLを皮下投与します。.マウスが直立した移動を回復するまで監視します。

4. データ分析

1. 「ProcessGUI」による4D再構成解析
   1. 再構成する前に、シナリオ「PulseRecon.scn」を選択し、パラメータファイル「IRESE_64pts_mouse_STANDARD_CHIRALITY.par」を読み込んでIRESEの生データを分析することにより、投影にベースライン補正を適用します。
   2. 選択したシナリオのデフォルト設定である 4 ポイントの幅のガウス フィルターを使用して、各投影をフィルタリングします。
   3. フィルタリングされた投影を 64 ポイント (マトリックス サイズ) にサブサンプリングします (選択したシナリオの既定の設定)。
   4. さらに、ナイキスト周波数の 0.6 倍のアポダイゼーションを持つ Ram-Lak フィルターを使用して、投影をフィルタリングします ([ 再構成パラメーター] |FilterCutOff) です。
   5. フィルタリングされた投影を逆投影して、4Dスペクトル空間イメージを生成します。
   6. フィッティング アルゴリズムを利用して、各ボクセルのスペクトルからスピン パケットの線幅を抽出します。セクション フィッティングパラメータ の設定: 最後のポイントエクステンダー - 3、フィット方法 - デフォルト。
   7. フィット手順のパラメータ (スペクトルの振幅、位相、スペクトル中心、スペクトル スピン パケットの線幅など) にはデフォルト設定を使用します。
2. 「ArbuzGUI」でのAnatomical USとEPROI間の登録(図4)
   注:登録の実行には、シカゴ大学のBoris Epel氏が開発した「ArbuzGUI」MATLABプロシージャを使用しました。このソフトウェアは、EPR-IT https://github.com/o2mdev/eprit で入手できます。登録ツールボックスについては、以前に他の場所で説明しました²⁷。詳細なステップバイステップの説明については、ユーザーマニュアル^{を参照してください28}。
   1. 2D US画像を1mmステップ(ステップはBモードイメージングのフレーム取得、ポイント3.3.7)のスタックとしてロードして、3D US画像を作成します。
   2. 収集したpO2画像(手順4.1で再構築)を「PO2_pEPRI」データとして設定した3D画像タイプとして追加します。プロジェクトにデータを保存します。
   3. レジストレーションシーケンスとトランスフォームを作成するには、 Special |MRI-EPRI登録。
   4. EPRIデータに調整する必要がある画像(例:US axial 3D)を選択するには、[ Sequence | add action]を選択します。 Stage 5:T2 を使用して、最高のパフォーマンスを実現します。結果では、選択した画像の名前の前に黒いプラス記号が表示されます。
   5. SliceMaskEditPLG で US 画像を開きます。画像に表示される定規に基づいて、米国の画像のスケールを調整します。選択したフレームに基づいて、US 位置マーカー、動物の輪郭、および腫瘍の位置をマークします。
   6. SliceMaskEditPLG で、再構築された 4D pO₂ イメージの pO₂ マップのアウトラインとフィデューシャルをマークします。
   7. Figure ビューアと RotateImagePLG ツールボックスを使用して、米国位置マーカーと基準位置に従って米国画像を回転させ、pO₂ マップを米国アウトラインで登録します。
   8. 腫瘍マスクを US 画像から pO₂ マップに変換します。
   9. マウスの pO₂ マップで腫瘍マスクを可視化し、各ボクセルの pO₂ 値をエクスポートします。

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結果

肩甲骨内脂肪パッドで増殖しているLN229腫瘍の超音波画像からの代表的な断面を、血管系とともに 図5に示します。腫瘍境界の外側に一部の血管系が見られます。意外なことに、腫瘍血管の体積の割合は減少せず、腫瘍の成長とともに安定していました。

図2に示すように、ステップ2では、マウスをベ?...

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ディスカッション

説明されているイメージングプロトコルには、いくつかの重要なステップがあります。まず、解剖学的画像を酸素マップに登録するためには、MRIは、より優れた解像度と詳細な3Dデータを提供する能力¹⁹のために、超音波よりも優れた選択肢であるかもしれない。高周波トランスデューサーを使用した超音波は、前臨床研究に優れた分解能と十分な?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
aqua pro injectione	Polpharma	1280610	-
ArbuzGUI	O2M Technologies	-	accesible in the github repository
disodium phosphate	POCH S.A.	799280115	-
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium - high glucose	Merck Life Science	D5648	4500 mg/L glucose and L-glutamine
fetal bovine serum	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10500064	-
fishing wire	Good Fish	A-55A-035	US position marker - 0.35 mm
Geltrex	Gibco, Thermo Fisher Scientific	A1413302	reduced growth factor basement membrane matrix
ibGUI	O2M Technologies	-	accesible in the github repository
injectio natrii chlorati isotonica	Polpharma	multipe items were used	9 mg/mL
insulin needles 29 G	Becton, Dickinson and Company	multipe items were used	-
Jiva 25	O2M Technologies	-	EPROI
MATLAB	MathWorks	-	version R2021b
penicillin-streptomycin	Merck Life Science	P4333	with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL
potassium chloride	POCH S.A.	739740114	-
potassium dihydrogen phosphate	POCH S.A.	742020112	-
ProcessGUI	O2M Technologies	-	accesible in the github repository
PTFE tubing	Cole Palmer Instrument Co	06412-11	-
sodium chloride	POCH S.A.	794121116	-
SpecMan4EPR	FEMI Instruments	-	version 3.4 CS 64bit
Surflash I.V. Catheter	Terumo	SR*FF2419	size: 24G x ¾"
tape	3M	multipe items were used	micropore
Trypsin-EDTA	Gibco, Thermo Fisher Scientific	25200072	-
Ultrasonography	Telemed	-	Anatomical US
US gel	KONIX	NUG-0019	-
Vetflurane	Virbac	137317	1000 mg/g
Vevo F2	FujiFilms, Visual Sonics	-	B-mode and Doppler
vinyl polysiloxane dental clay	3M ESPE	multiple items were used	-