サーマルシフトアッセイによるセレノプロテインOへの基質結合のプローブ

要約

ここでは、低分子の目的のタンパク質への結合を調査するために使用されるハイスループットの蛍光ベースの手法であるサーマルシフトアッセイを紹介します。

要約

未知の機能を持つタンパク質の生物学的重要性を定義することは、細胞プロセスの理解において大きな障害となります。バイオインフォマティクスや構造予測は未知のタンパク質の研究に貢献してきましたが、 in vitro での実験的検証は、生化学的活性に必要な最適な条件や補因子によって妨げられることがよくあります。補因子の結合は、一部の酵素の活性に不可欠であるだけでなく、タンパク質の熱安定性を高める可能性もあります。この現象の実用化の1つは、タンパク質の融解温度の変化によって測定される熱安定性の変化を利用して、リガンドの結合を調べることです。

サーマルシフトアッセイ(TSA)は、目的のタンパク質へのさまざまなリガンドの結合を分析したり、X線結晶構造解析などの実験を実行するための安定化条件を見つけたりするために使用できます。ここでは、金属とヌクレオチドの結合を試験するためのシンプルでハイスループットな方法として、シュードキナーゼであるSelenoprotein O(SelO)を利用したTSAのプロトコールについて説明します。標準的なキナーゼとは対照的に、SelOは逆向きにATPに結合し、タンパク質AMPylationとして知られる翻訳後修飾でAMPのタンパク質のヒドロキシル側鎖への移動を触媒します。融解温度の変化を活用することで、SelO機能の根底にある分子相互作用に関する重要な洞察を提供します。

概要

ヒトプロテオームの多くは、まだ十分に特徴付けられていません。Dunham氏とKustatscher氏らが提唱した「街灯効果」とは、広く研究されたタンパク質が注目され、研究が進んでいないタンパク質が見落とされる現象を指します^1,2。この影響に寄与する要因には、特定のタンパク質の生物学的重要性と疾患関連性が含まれます。さらに、基礎知識を提供する先行研究や、機能解析のためのツールの利用可能性は、高度に研究されているタンパク質の研究をさらに刺激します^1,2。Understudy Proteins Initiative、Structural Genomics Consortium、Enzyme Function Initiativeなどのプロジェクトは、構造的および機能的プロテオミクス^2,3,4を使用して、研究が進んでいないタンパク質の特性評価を目指しています。研究が進んでいないタンパク質の分子機能を特定するための補完的なアプローチは、これらのタンパク質と低....

プロトコル

1. 実験セットアップ

1. RT-PCR装置などの蛍光を検出できるサーマルサイクラーを使用して、記載されているプロトコールを実行します。このプロトコルで説明されているように、SYPRO Orangeを使用する場合は、約470 nmの励起と約570 nmの発光検出を可能にするスキャンモードを使用します。サーモサイクラーをプログラムして、サンプルを20°Cで2分間保持し、その後、0.5°C/1分間の温度を95°Cまで上昇させます。1°Cごとに蛍光強度を測定します。
   注:サイクルの最後に、サンプルブロックを20°Cに戻すためのオプションのステップをお勧めします(図1)。
2. 各反応には、バッファー、目的タンパク質、添加剤、外因性蛍光色素の4つの成分が含まれています。タンパク質なし、色素なし、添加物なし、添加剤なし、添加剤のみなどのコントロールを含むように実験を設計し、結果の解釈に影響を与える可能性のあるバックグラウンド蛍光を決定します。利用可能な場合は、目的のタンパク質に結合して安定化することが知られている添加剤などのポジティブコントロールを含めます。
3. アッセイには精製タンパク質を使用してください。この例に従うために、前述の^25,29

ディスカッション

サーマルシフトアッセイ(TSA)は、補因子や阻害剤との相互作用を含むタンパク質-リガンド相互作用をスクリーニングするための効率的な方法として機能します。このプロトコルでは、TSAを使用して、シュードキナーゼSelOのヌクレオチドおよび二価カチオンへの結合を測定しました。私たちの調査結果は、SelOがATPおよびMg²⁺/Mn²⁺の存在下で増加した熱安.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate	Sigma Aldrich	A2383-10G	used for representative results but not required to perfom TSA
Avanti J-15R with microplate carrier assembly	Beckman Coulter	C19416
CFX Opus 384 Real-time PCR system	Bio-Rad	12011452
Hard-Shell 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white	Bio-Rad	HSP3805
Magnesium Chloride	Sigma Aldrich	M8266-100G	used for representative results but not required to perfom TSA
Manganese (II) chloride tetrahydrate	Sigma Aldrich	M3634-500G	used for representative results but not required to perfom TSA
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical	Bio-Rad	MSB1001
SYPRO Orange Protein Gel stain	Sigma Aldrich	S5692-500UL
Uridine 5′-triphosphate trisodium salt hydrate	Sigma Aldrich	U6625-100MG	used for representative results but not required to perfom TSA