N-メチル-N-ニトロソ尿素誘発ラット網膜損傷のサンプリングと病理学的変化のマルチインデックス評価

要約

このプロトコルは、N-メチル-N-ニトロソウレアの腹腔内注射後の網膜の病理学的変化とアポトーシスを検出するための、ラット網膜サンプリングおよびヘマトキシリン-エオシン染色、TUNELアッセイ、およびウェスタンブロットの利用手順を説明しています。

要約

網膜症は、ほとんどの眼疾患および糖尿病の晩期合併症で観察できます。特定の色素上皮細胞と視神経細胞の損傷と変性が網膜症の主な特徴です。多くの伝統医学は、網膜症の治療において実質的な臨床効果を示しています。網膜を迅速かつ完全に取得する方法は、網膜症の治療のための伝統医学研究における重要なステップです。この研究では、N-メチル-N-ニトロソウレア (MNU) 誘発ラットの網膜損傷のサンプリングと病理学的変化のマルチインデックス評価のための標準化された運動可能な手順を提供することを目指しています。ラットに60 mg/kg MNUを腹腔内注射して網膜損傷を誘発し、7日後に網膜サンプルを採取した。さらに、網膜の病理学的変化を評価するためにヘマトキシリン-エオシン染色を行いました。TUNELおよびウェスタンブロットによるアポトーシス速度およびアポトーシスタンパク質の測定。網膜サンプリングと病理学的変化の評価のためのこれらの標準化されたプロトコルは、網膜症のメカニズムの探求と新規で効果的な伝統的なハーブの発見を促進するのに役立ちます。

概要

網膜色素変性症(RP)は、遺伝性の失明を伴う網膜疾患^です1。RPの発生率は1/3500から1/5000の間で、世界の約250万人の視覚機能に影響を及ぼしています。ヒトの視覚障害につながる疾患として最もよく知られており、社会全体に大きな負担を強いています²。この疾患は、網膜色素上皮細胞の機能が徐々に失われ、光受容体の進行性アポトーシスを特徴としています。初期段階では、患者は夜盲症を経験し、それが末梢視野欠損として現れ、最終的には中心視力の喪失につながります³。したがって、網膜光受容体アポトーシスの阻害は、RPの予防と治療のポイントカットです。

網膜細胞のアポトーシスは、ヒトRPおよびモデル動物に共通する特徴^です4。ラットに 60 mg/kg N-メチル-N-ニトロソウレア (MNU) を 7 日間腹腔内注射すると、アポトーシスと網膜光受容体細胞の喪失が誘発され、RP ^5,6 の一般的に使用される動物モデルです。モデル動物における網膜組織の病理学的構造、特異的細胞アポトーシス、およびアポトーシス関連タンパク質発現の変化を解析することは、ヒトRPおよびスクリーニング薬物の病因を研究する上で効果的な実験データと理論的支持を提供することができる^7,8。したがって、網膜標本の品質は実験データの信頼性を決定します。しかし、眼組織の特殊性のために、ラット網膜⁹を得る方法に関する報告は非常に少ない。

この論文では、上記の欠点を克服するために、ラットの網膜サンプリングのためのシンプルで高速、標準化された、操作可能な手順を提供します。ヘマトキシリン-エオシン染色(HE)、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介デオキシウリジン三リン酸-ジゴキシゲニンニックエンド標識(TUNEL)染色、およびウェスタンブロットを使用して、ラットの網膜組織損傷とアポトーシスの病理学的変化を解析します。すべての方法は、特定の運用プロセスに関する私たちの研究グループの経験から導き出されています。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

プロトコル

すべてのプロトコルと外科的処置は、寧夏医科大学の倫理委員会によって承認されました(倫理番号:NO.2020-Q066)。7〜8週齢、体重200〜220 gのSPF Sprauge-Dawley(SD)雄ラットを、寧夏医科大学から動物免許番号SCXK(Ning)2020-0001で購入しました。すべての動物は寧夏回族自治区医科大学の実験動物センターで飼育されました。温度と湿度は適切で、昼夜の光サイクルは維持され、食料と水は無料で十分でした。

1. 術前準備

1. 材料の準備
   1. ラットプレート、吸入麻酔器、埋め込みボックス、凍結保存チューブ、使い捨て手術用手袋とマスク、広口ボトル、4%パラホルムアルデヒド、アイスパック、眼科用ハサミ、眼科用ピンセット、手術用刃物とナイフハンドル、1.5mLの微量遠心チューブを準備し、事前に滅菌してください( 材料の表を参照)。
2. 動物の調理法
   1. 20匹の雄SDラットをモデルグループ(n = 10)とコントロールグループ(n = 10)にランダムに分けます。モデルラットに60 mg / kg MNUを腹腔内に注射し、対照ラットに同量の生理食塩水を腹腔内に注射します。.
   2. 注射の7日後、ラットを絶食させ、サンプリングの前夜に自由に飲ませます。
   3. 翌日、ラットの仰臥位を手術台に置き、マスクを使用して4%イソフルランと2L / min酸素を使用して麻酔を投与します。.足の中心をつまんで麻酔の深さを測定し、ラットの反応を観察します。

2. タンパク質因子検出のためのレチナールサンプリング

1. 左手でラットの眼窩を固定し、眼科用曲げ鉗子を使用して右手で適度な力で眼球を切除します。眼球を冷たいガラス皿の矢状位置に置きます。
2. 左手で眼科用ストレートピンセットを持って眼球を固定し、右手で手術用ブレードを保持した状態で、レンズ部位の近くに縦方向に2mmの切開を行います。
3. 切開部に沿って眼ハサミで角膜を切り取り、水晶体、硝子体をそっと剥がし、アイカップを露出させます。
4. アイカップの底を1.5mLの微量遠心チューブの先端に置き、アイカップをチューブの上にひっくり返して網膜を露出させます(網膜はうっすらと黄色になります)。
5. 眼科用曲げピンセットで眼球の強膜壁に沿って網膜全体を切除し、冷凍チューブに入れて液体窒素タンクに保管します(図1)。

3. 病理検査および特異的細胞染色のためのレチナールサンプリング

1. 左手で、目のピンセットを使用してラットの目の角を持ち上げます。右手で、外科用ブレードを使用して、ラットの目の角に沿って4mmの開口部を切ります。
2. アイピンセットを使用して、眼球の端を左手の開口部に固定します。眼ハサミを使って、眼球の周辺組織の洗浄に注意しながら、眼球の縁に沿って周囲の組織を切り取ります。
3. 眼球の後極にある視神経の周りの組織をピンセットで分離し、視神経を切断し、その保存に注意を払います。次に、眼球を取り外します。
4. 取り除いた眼球を生理食塩水で洗って残った血液を取り除き、濾紙の上で転がして余分な水分を吸収し、冷たい錫箔の上に置きます。
5. 眼科用ピンセットで目を固定します。角膜と網膜の接合部に沿って、外科用ブレードで縦方向に4mmの切開を行います。
6. 眼科用ハサミで角膜を切除し、切開部に沿って円形の切り込みを入れ、水晶体と硝子体をやさしく取り除きます。
7. 視神経を埋め込んだ残りのアイカップを埋め込みボックスに入れ、4%パラホルムアルデヒドで固定します。
8. パラホルムアルデヒド固定サンプルをパラフィンに包埋し、HE染色およびTUNEL染色⁷のために4 μmスライスにカットします。

4. ラット網膜のHE染色

1. 脱ロウと水和:スライスをキシレンに10分間置き、このプロセスをさらに10分間繰り返し、続いて無水エタノールを5分間、エタノール処理をさらに5分間繰り返し、続いて95%アルコールで5分間処理し、次に85%アルコールで5分間、最後に75%アルコールで5分間処理します。
2. ヘマトキシリン染色:スライスを脱イオン水で5分間すすぎます。100 μLのヘマトキシリン染色溶液を使用し、5分間染色し、脱イオン水で5〜10秒間すすぎます。1%塩酸エタノール100μLを30秒間加え、脱イオン水で20分間すすぎ、0.2%アンモニア水100μLを1分間加えます。脱イオン水で5分間すすいでください。
3. エオシン染色:100 μLのエオシン染色溶液を使用して5分間染色し、脱イオン水で30秒間すすぎます。
4. 脱水と密封:スライスを70%アルコールに5分間浸し、次に85%アルコールに5分間浸し、続いて90%アルコールに5分間、無水エタノールに5分間浸します。無水エタノール処理をさらに5分間繰り返し、次にキシレンに5分間浸漬し、さらに5分間このプロセスを繰り返します。最後に、スライスの表面に約100μLの中性樹脂を加えてシールし、カバーガラスで覆います。
5. スライドのイメージング:染色したスライスを顕微鏡に配置し、画像がはっきりと見えるまで顕微鏡の焦点を調整し、倍率を400倍に設定して、画像をキャプチャします。
6. 網膜全体の厚さと外側の網膜の厚さを測定する:網膜全体の厚さと外側の網膜の厚さ(外側の核層と視細胞層の厚さ)を測定し、外側の網膜の厚さのパーセンテージを計算します
   外側網膜の厚さ (%) = (外側網膜の厚さ/網膜全体の厚さ) x 100。

5. TUNEL法による網膜視細胞のアポトーシス率の測定

1. 脱ロウと水和:スライスをキシレンに10分間置き、このプロセスをさらに10分間繰り返し、次に無水エタノールに5分間入れ、この手順をさらに5分間繰り返します。アルコール95%に5分、アルコール90%に5分、アルコール80%に5分、アルコール70%に5分入れて脱水を行い、脱イオン水で5分間すすぎます。
2. 0.85%塩化ナトリウム溶液で5分間、PBSで5分間すすぎます。4%パラホルムアルデヒドを使用してパラホルムアルデヒドで15分間固定します。PBSで5分間すすぎ、さらに5分間このプロセスを繰り返します。
3. インキュベーションと平衡化⁷:20 μg/mL プロテイナーゼ K 溶液とインキュベートして 15 分間消化し、平衡バッファーで 10 分間平衡化し、組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ (rTdT) バッファーと 37 °C で 60 分間インキュベートします。
4. 反応停止:標準クエン酸溶液(2x SSC溶液)100 μLを15分間加えます。PBSで5分間すすぎ、さらに5分間このプロセスを繰り返します。
5. 核色素:100 μL 4′, 6-ジアミジン-2-フェニンドル(DAPI)試薬を5分間添加します。脱イオン水で5分間洗浄し、さらに5分間このプロセスを繰り返します。
6. シール:スライスの周りの余分なキシレンを拭き取り、スライスの表面に約100μLの中性樹脂を加えてシールし、カバーガラスで覆います。
7. 顕微鏡検査:染色したスライスを顕微鏡に置き、顕微鏡の焦点を調整してはっきりと見えるようにし、倍率を400倍に設定して、画像をキャプチャします。標準的な蛍光フィルターを使用して、520 nm±20 nmの緑色蛍光を観察します。460nmで青色のDAPIを観察します。
8. アポトーシス率を計算する:外側の網膜核層の緑色の蛍光値と青色の蛍光値を測定します。アポトーシス率を次のように計算します。
   アポトーシス細胞速度=緑色蛍光値/青色蛍光値×100。

6. ウェスタンブロット解析 ¹⁰

1. 溶解バッファー処理:凍結した1つの網膜を50 μLの冷溶解バッファー(5 μLのホスファターゼ阻害剤、1 μLのプロテアーゼ阻害剤、および5 μLの100 mM PMSFを含む溶解バッファー1 mL)でミンチしてホモジナイズします。
2. 氷浴で5秒間28kHzの超音波処理を行います。3回繰り返します。4°Cで10,000 x g で5分間遠心分離し、細胞の破片を除去します。上澄みを保管してください。
3. em>6.3タンパク質の定量:BCAタンパク質アッセイ試薬キットを使用してタンパク質濃度を測定します。
4. em>6.4電気泳動:50 μgのタンパク質サンプルをロードし、12%ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)で分離します。
5. メンブレンへの転写:電気泳動転写システムを使用してPVDFメンブレンに電気泳動で転写します。
6. メンブレンの細分化:メンブレンを細分化し、目的の各タンパク質、β-アクチンおよびGAPDHを1回の転写で分析します。
7. ブロッキング:室温で5%の脱脂乳を含むTBSTでメンブレンを1時間ブロックします。
8. 一次抗体のインキュベート:切断されたカスパーゼ-9(1:200希釈)、切断されたカスパーゼ-3(1:200希釈)、切断されたカスパーゼ-7(1:200希釈)、およびβ-アクチン(1:1000希釈)の一次抗体と4°Cで一晩インキュベートします。 メンブレンをTBSTで5分間洗浄し、3回繰り返します。
9. 2つ目の抗体をインキュベートする:西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体(1:2000)と室温で2時間インキュベートします。メンブレンをTBSTで5分間洗浄し、3回繰り返します。
10. 露光:ウェスタンブロット基質を使用して標識タンパク質を可視化し、最後にメンブレンを露光して自動露光モードでタンパク質バンドを可視化します。
11. タンパク質バンド密度を測定することにより、タンパク質含有量⁷ を計算する。

7. 統計解析

1. SPSS 19.0ソフトウェアを使用してデータを分析し、平均±標準偏差として表示します。一元配置分散分析を使用して、観測値の統計分析を実行します。p< 0.05を統計的に有意とみなします。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

結果

HE染色後、対照群のラットのすべての網膜層は、明確な組織構造、整然とした細胞配置、および均一な染色を示しましたが、モデル群のラットの網膜構造は著しく損傷を受け、外側の網膜層はより薄く、外側の核層は内側のコア層とほぼ完全に統合され、層内の細胞の配置は非常に無秩序でした。 細胞層の数が大幅に減少し、感光性細胞層と外側核層の厚さが大幅に...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

ディスカッション

RPは、診療所でよく見られる網膜疾患です。RPの発症、重症度、および進行は、遺伝子と遺伝的様式に関連しており、環境の影響を受けます^8,11。RPには家族性RPと時折のRPが含まれ、そのうち家族性RPは患者の約60%を占めています。家族の遺伝歴をたどることで、これまでにRPに関連する遺伝子が83個同定されていますが、た?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amersham Imager	GE	680
Ammonium persulfate	Boster Biological Technology Co.,Ltd	A8090
Analytical Balance	Mettler Toledo	ME104E
BCA protein quantization kit	Ken Gen Biotech. Co. Ltd	KGP902
cleaved caspase-3 antibody	Cell Signaling Technology	#9664
cleaved caspase-7 antibody	Cell Signaling Technology	#8438
cleaved caspase-9 antibody	Cell Signaling Technology	#9507
DeadEnd Fluorometric TUNEL System	Promega	G3250
Glycine	Boster Biological Technology Co.,Ltd	AR1200
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)	Bioss Antibodies	bs-80295G-HRP
Goat serum	Biosharp	BL210A
High speed  crusher	Thermo Fisher Scientific	AG22331
Immobilon-P SQ Transfer membranes	Merck Millipore. Ltd	ISEQ00010
Isoflurane	RWD Life Science	R510-22-10
Methanol	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd	20230108
Microplate Reader	Thermo Fisher Scientific	1510
Microscope	Olympus	IX73
Microscope slide	Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd	7105P-G
Mini-PROTEAN Tetra	BIO-RAD	1658001
N-Methyl-N-Nitrosourea	sigma-Aldrich	N4766–100G
Oven	Shanghai Yuejin Medical Equipment Co., Ltd	DHG-8145
Page Pre-solution (30% )	Doublehelix Biology Science and Technology Co.,Ltd	L3202A
PageRuler Prestained Protein Ladder	Thermo Fisher Scientific	26617
PBS buffer	Biosharp	G4202
SDS-PAGE Protein loading buffer (5×)	Beyotime Biotechnology	P0015
Skim milk powder	BioFroxx	1172GR500
Sprague Dawley rats	Ningxia Medical University	SCXK (Ning) 2020-0001
TEMED	Boster Biological Technology Co.,Ltd	AR1165
Total protein extraction kit	Ken Gen Biotech. Co. Ltd	KGP2100
Trans-Blot Module	BIO-RAD	1703935
Tris base	Boster Biological Technology Co.,Ltd	AR1162
Tweezer	Changde BKMAM Biotechnology Co., Ltd	130302027
β-actin	Cell Signaling Technology	#4970