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要約

ナチュラルキラー細胞由来の細胞外小胞(NK-EV)は、がんのバイオ医薬品として有望な可能性を秘めています。この方法論に基づく研究では、高純度のNK-EVを大量に連続的に生産および分離するように設計された、スケーラブルなクローズドループバイオ製造ワークフローを示しています。インプロセス制御試験は、バイオマニュファクチャリングのワークフロー全体で実施され、EVが製品リリースの品質基準を満たしていることが確認されます。

要約

ナチュラルキラー細胞由来の細胞外小胞(NK-EV)は、がんのバイオ医薬品として研究されています。それらは、がん細胞を標的とする細胞傷害性ナノベシクルとして、また免疫調節コミュニケーターとして独自の特性を持っています。スケーラブルなバイオマニュファクチャリングワークフローにより、前臨床および臨床の要求を満たす高純度のNK-EVを大量に生産することができます。このワークフローでは、閉ループ中空糸バイオリアクターを採用しており、Good Manufacturing Practices基準に準拠した無血清、ゼノフリー、フィーダーフリー、抗生物質フリーの条件下でNK92-MI細胞株からのNK-EVの連続生産を可能にします。このプロトコール主導の研究では、サイズ排除クロマトグラフィー、限外ろ過、およびフィルターベースの滅菌を使用してNK-EVを分離するためのバイオマニュファクチャリングワークフローを概説しています。NK-EV製品の重要な特性評価は、ナノ粒子追跡分析によって行われ、その機能は、がん細胞に対する検証済みの細胞生存率ベースの効力アッセイを通じて評価されます。このスケーラブルなバイオ製造プロセスは、ベストプラクティスを遵守し、再現性を確保することにより、NK-EVベースのがんバイオ医薬品の臨床応用を前進させる大きな可能性を秘めています。

概要

21世紀に入り、がんとの闘いは目覚ましい進歩を遂げました。これは主に、免疫系を利用してがんと戦う薬の一種であるがん免疫療法の台頭によるものです。ナチュラルキラー細胞由来細胞外小胞(NK-EV)は、拡大する免疫療法の領域において有望な候補です。自然免疫と適応免疫の統合的なNK細胞は、ウイルスに感染した細胞、ストレスを受けた細胞、悪性細胞に対する体の防御に重要な役割を果たします。彼らは、細胞傷害性手段1,2,3を通じて異常な細胞を排除するために、抗癌機械の包括的な武器を採用しています。これらのメカニズムの中には、細胞間コミュニケーションの促進に重要なタンパク質、RNA、DNAなどのさまざまな生体分子を含むナノスケールの二重層構造であるEVの産生と分泌があります4,5,6。NK-EVは、そのユニークなキャリア特性により、有望な無細胞治療薬として浮上しています。これらには、フィルターベースの滅菌を可能にする小さなサイズ、高い生体適合性、腫瘍内での優先的な蓄積、幅広い貨物送達スペクトル、血液脳関門などの生物学的障壁を克服する能力、および最小限の毒性プロファイルが含まれます。いくつかの理由から、NK-EVは、投与前に化学療法による患者のリンパ球除去の必要性を排除します:1)従来、リンパ球除去は、細胞ベースの治療のためのより快適な環境を作り出すために採用されており、注入された細胞が増殖し、その治療効果を発揮することを可能にします。2)細胞とは異なり、EVは複製能力を欠き、規模が大幅に小さい。3)EVは異なるメカニズムで作動し、細胞と比較して免疫原性が低下します5,6,7。さらに、NK-EVは、さまざまながんモデルに対して一貫してin vitroでの有効性を示し、抗がん応答を促進する免疫細胞に対する免疫調節効果も示しています8,9。In vivoの結果はこれらの知見を裏付けており、NK-EV治療後のがんの退縮と毒性は無視できることを示しています10,11,12。したがって、NK-EVベースの治療薬は、冷たく免疫学的に不活性な固形腫瘍13,14,15,16,17の治療の課題に対処するために大きな期待が寄せられています。

私たちの最近の研究では、バイオマニュファクチャリング7によるNK-EVの臨床翻訳における重大なボトルネックに対処しています。この記事では、インプロセス品質管理試験を確実に実施するために細心の注意を払って設計されたNK-EVの、費用対効果が高くスケーラブルなバイオマニュファクチャリングワークフローの概念実証を紹介しています。このアプローチにより、高純度のNK-EVベースのがんバイオ医薬品が大量に生産され、MISEV2018ガイドライン18に従って徹底的な製品特性評価が行われました。バイオマニュファクチャリングワークフローのスケーラビリティは、カートリッジサイズを大きくするか、複数のバイオリアクターを並行して稼働させることで実現できます。同様に、高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)ベースのサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)、限外ろ過(UF)、フィルターベースの滅菌などの技術を使用して、EV分離ワークフローのスケーラビリティを簡単に実現できます。閉ループ中空糸バイオリアクター(HFB)システムは、血清補給、フィーダーシステム、および抗生物質を必要とせずに、IL-2自給自足NK細胞株(NK92-MI細胞)を増殖させました。これは、市販の化学的に定義されたゼノフリーの培地を使用して達成されました(GMPバージョンは現在市販されています)。その結果、1つの中型バイオリアクターカートリッジを使用して、大量のNK細胞(109 生細胞)とNK-EV(1012 EV)が5〜7日以内に成功裏に生産され、両方の製品が広範囲に特性評価されました。バイオ製造プロセス全体を通じて、pH、グルコース、乳酸レベルなどの定量化可能な指標と、培地の色や汚染の兆候などの視覚的な指標を使用して、細胞の健康状態を毎日監視しました。HFBシステムで生成されたNK細胞の生存率と機能、特に細胞毒性の収穫後の評価により、フラスコベースの培養と比較して有意な改善が明らかになりました7。同様に、精製されたNK-EVは、細菌、マイコプラズマ、一般的なウイルス実体、および細胞成分を含まず、エンドトキシンレベルが無視できる高純度プロファイルを示しました。重要なことに、精製されたNK-EVは、最終製品に含まれるすべてのナノ粒子の99.9%以上を占めていました7。最後に、これらの精製されたNK-EVは、表面マーカー(CD2、CD45、CD56)、サイトカインペイロード(GzmB、PFN、IFN-g)などの主要なNK特性を保持し、白血病K562細胞に対して強力な細胞毒性を示しました。これは、NK細胞の細胞毒性を評価するためのゴールドスタンダードラインです7。

本プロトコルは、上記で説明したスケーラブルなバイオマニュファクチャリングワークフローを詳述しています。FPLC-SECとUFおよびフィルターベースの滅菌を組み合わせて製造したNK-EVを分離する方法を解明します。さらに、このプロトコルでは、ナノ粒子追跡分析(NTA)を使用した製品の特性評価、さまざまなツール(タンパク質/dsDNA定量および微生物試験)を使用した品質評価、細胞生存率アッセイによるがん細胞に対する精製NK-EV製品の機能検証など、極めて重要なステップについて説明しています。通常、このワークフローでは、平均濃度が1.18 x 1012 EV/mL7の1.0 - 1.5 mLのNK-EV製品が得られ、約40 mLのEVリッチCMに基づいて合計で最小1 x10 12 EVが得られます。このプロセスにより、治験、前臨床、マルチオミクス(プロテオミクス、トランスクリプトミクス、ゲノミクス、メタボロミクス、リピドミクス、エピゲノミクス)研究など、高品質なEVを大量に必要とする研究や、臨床への応用が実証された再現性を持つさまざまなダウンストリームアプリケーション向けの製品リリースが可能になります。

プロトコル

1. 閉ループバイオリアクターを用いたNK92-MI細胞からのNK-EVバイオ製造

注:NK-EVは、GMP(Good Manufacturing Practices)に準拠し、NK92-MI細胞を利用したスケーラブルなバイオマニュファクチャリングワークフローを使用して製造されています( 図1を参照)。私たちの最近の出版物には、バイオ製造手順とNK-EV製品のアイデンティティと安全性プロファイルに関する詳細な洞察が掲載されています7。

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図1:スケーラブルな分離ワークフローを備えた閉ループ中空糸バイオリアクター(HFB)におけるナチュラルキラー細胞由来細胞外小胞(NK-EV)のバイオマニュファ ス。高純度のNK-EV製品を大量に生成するためのバイオマニュファクチャリングワークフローの概略図。IL-2 自給自足型 NK92-MI 細胞を閉ループ HFB カートリッジに播種し、無血清 (SF)、ゼノフリー (XF)、フィーダーフリー、および抗生物質フリーの条件下で培養し、EV に富んだ馴化培地を連続的に収集するために増殖します。EVリッチCMからのNK-EV単離は、Fast Protein Liquid Chromatographyベースのサイズ排除クロマトグラフィー(FPLC-SEC)と限外ろ過(UF)の組み合わせによって行われます。NK-EVは、複数のアッセイを通じて特性評価および評価され、K562白血病細胞に対するその機能性は、生存力価アッセイを使用して評価されます。このフィギュアは7(Biorender.com で作成)から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

  1. 1 - 5 x 106 NK92-MI細胞から開始し、細胞密度を3 - 8 x 105 細胞/mLに維持し、予め加温した培地を使用してT25 - T175フラスコで細胞を培養します。37°Cで5% CO2 とインキュベートします( 材料表を参照)。1 x 108 NK92-MI細胞が少なくとも70%の生存率で産生されるまで、2〜3日ごとに培地を交換します。
    注:細胞を再播種するときは、好ましい成長因子が含まれているため、馴化培地(CM)の1/5〜1/3rd を保管してください。
  2. 培地HFBカートリッジの調製とNK細胞の接種を下記の方法で行ってください。
    注:すべての操作は、無菌性を確保し維持するために、クラスIIのバイオセーフティキャビネット内で行う必要があります。カートリッジシステムをバイオセーフティキャビネットに移動する前に、リザーバーのボトルネックとシリンジ接続に特に注意を払いながら、70%エタノールをたっぷりとスプレーしてください。
    1. 以下に説明するように、製造元の指示に従ってHFBカートリッジを準備します19 ( 資料の表を参照、 図2を参照)。
      1. ルアーロック接続部をワックスフィルムで包み、製造元の指示に従ってポンプの流量を調整します19。HFBカートリッジをコンディショニングし、150 mLの滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS; 材料表を参照)を少なくとも5日間循環させます。.
      2. 細胞外毛細血管腔(ECS、容量は約29mL)から空気を抜くには、左のECSポートから約40mLのPBSを注入し、右のECSポートから空気を逃がします。その際、左右の端のポートクランプを閉じます。シリンジが常に左右のECSポートに接続されていることを確認してください。
      3. 完了したら、カートリッジをインキュベーター内のフローポンプ( 材料の表を参照)に置き、37°Cおよび5%CO2に設定します。数日の循環後に漏れがないことを確認してください。
    2. PBSをリザーバーボトル内の150 mLの培地と交換し、ECSをカートリッジに播種する2日前に交換します。前のコンディショニング手順(ステップ1.2.1)を、培地を使用して2日間循環させます。
    3. 細胞を播種する前に、リザーバーボトルとECSの内容物を250 mLの新鮮な培地と交換してください。
    4. インキュベーターから培養フラスコを取り出し、細胞を50mLチューブに移します。300 x g で5分間遠心します。21 mLの培地を使用して細胞ペレットを再懸濁します。
    5. 細胞懸濁液からそれぞれ20.5 μLのアリコートを2つ調製し、自動セルカウンターで細胞カウントを行います( 材料表を参照)。各20.5 μL細胞懸濁液分注に、同量のAO/PI色素( 材料表を参照)を加え、少なくとも10倍に混合します。
      注:正確なNK細胞のカウントのためにTrypan Blueはお勧めしません。または、手動でカウントするために血球計算盤を使用します。
    6. カウントスライドの各カウントチャンバーに20μLをロードし、適切なプログラムを使用して自動セルカウントを実行します。平均生細胞濃度を計算し、生存率を記録します。
    7. NK細胞溶液を数回混合してから、20 mLのシリンジと18 Gの針を使用して吸引し、無菌性を維持します。この溶液には、約20 mLまたは約5 x 106細胞/mLに約1 x 108個の生NK細胞が含まれている必要があります。
    8. シリンジから針を抜いた後、左側のECSポートからNK細胞をカートリッジに静かに注入します。カートリッジ全体に細胞が均一に分散するように、左右のECSポートに接続されたシリンジを使用して、細胞溶液を少なくとも10倍静かに往復させます。
      注:溶液は、左端と右端のポートが閉じた状態で、両方のシリンジで濁度が等しい必要があります。
    9. 左右の端のポートを開き、シリンジ内に残っているものを注入します。クランプを使用して、左右のECSポートを閉じます。
    10. カートリッジをインキュベーターに移し、30分間放置してから、フローポンプに適切に取り付けます。カートリッジはバイオマニュファクチャリングのためにそのままにしておきます。メーカーにより流量を調整してください。
    11. 細胞の健康状態の指標をモニタリングするには、リザーバーボトル内の完全に混合された培地から毎日0.5 mLの培地を取得し、グルコースとpHレベルを確認した後、-20°Cで保存します。L-乳酸レベルは後で確認することができます( 資料の表を参照)。
    12. リザーバー内の培地(250〜500 mL)を1〜2日ごとに交換して、グルコース含有量を培地に見られる初期レベルの50%以上に維持し、pHを7.0〜8.0(7.0〜8.0の範囲)に維持します。
  3. NK-EVリッチCMの収集は、1日の休息後、最初にカートリッジを播種するときに、以下に説明するように毎日実行します。
    1. カートリッジシステムをバイオセーフティキャビネットに移動します。約21 mLの培地を左側のECSポートから静かに注入し、同量のEVリッチCMを右側のECSに押し込みます(混合しないでください)( 図3を参照)。
      注意: 汚染を防ぐために、常に新しいプラスチック製品を使用してください。
    2. EVリッチCM溶液を50 mLチューブに移し、300 x g で5分間遠心分離します。その間に、カートリッジシステムをフローポンプのインキュベーターに戻します。
    3. 上清を新しいチューブに移し、2000 x g で10分間遠心分離します。再度、上清を新しいチューブに移します。次に、EV-rich CMを3、50 mLチューブ(~7 mL/チューブ)に均等に分注し、さらなる処理まで-80°Cで保存します。
      注:シーケンシャルに収集されたEVリッチCMは、これら3つのチューブにプールされ、3つのテクニカルレプリケートサンプルチューブが生成されます。
  4. HFB-NKセルハーベストを行い、以下で説明するのと同じHFBカートリッジを使用してEVリッチCMを作製し続けます。
    注:カートリッジがコンフルエンス(最大1 x 109 細胞)に達すると、「HFB-NK細胞回収プロトコル」を実行することにより、HFBのECSからNK細胞を回収できます。これは、各ロットの5〜7日後、またはグルコース含有量がグルコースメーターの検出限界を下回っている(たとえば、読み取り値がない、または~0の読み取り値)ことが2日間連続して検出された場合に発生します。これが最終的なセルハーベストである場合は、培地をPBSに置き換えてカートリッジをフラッシュし、細胞を回収することができます。
    1. 上記のステップ1.3で詳述したとおりに、EVが豊富なCMを収集します。
    2. 左のECSポートから約50 mLの培地を注入します。カートリッジ全体に細胞を均一に分散させるには、左右のECSポートに接続されたシリンジを使用して細胞溶液を少なくとも10倍ゆっくりと前後に押して細胞を緩め、最終的にシリンジで右のECSポートに押し込んで収集します。採取したEVリッチCMを50mLチューブに移します。とりあえず37°C(ウォーターバスまたはインキュベーター)に置いておきます。
      注:プッシュバックアクションは、細胞が完全に排出され、右のECSポートを介してシリンジによって収集される前に、細胞を取り除くのに役立ちます。溶液は、左端と右端のポートが閉じた状態で、両方のシリンジで濁度が等しい必要があります。バイオリアクターカートリッジを軽くたたく(物理的外乱)と、カートリッジの下部にある細胞クラスターを先手ずくべることができます。細胞懸濁液の積極的な逆混合は、回収された細胞の生存率に悪影響を与える可能性があります。生存率を最大化するために、注意と忍耐を適用する必要があります。
    3. 最後の手順を2回繰り返します。合計で150 mLの細胞懸濁液を回収する必要があります。300 x g で5分間遠心分離し、上清を捨てます。
    4. 両方の細胞ペレットをそれぞれ20 mLの新鮮な培地に再懸濁し、それらを組み合わせます。各細胞懸濁液20.5 μLのアリコートを2つ集めて、自動セルカウンターで細胞カウントします( 材料表を参照)。
      注:通常、希釈剤としてPBSを使用する多数の細胞希釈液は、セルカウンターのダイナミックレンジ内に収まる必要があります。
    5. 20.5 μLの細胞懸濁液分注に、同量のAO/PI色素( 材料表を参照)を加え、少なくとも10倍に混ぜ合わせます。カウントスライドの各カウントチャンバーに20μLをロードし、適切なプログラムを使用して自動セルカウントを実行します。
    6. 希釈補正されたすべてのカウントの生細胞濃度を平均化し、生細胞の総量を決定し、生存率を記録します。上記で詳述したように、同じバイオリアクターカートリッジを使用してEVリッチCMを連続的に作製するには、1 x 108 HFB産生NK細胞を再播種します。
      注:必要に応じて、HFBで作製したNK細胞は、凍結保存用凍結培地と凍結容器を使用して保存し、凍結速度を制御することができます( 材料の表を参照)。

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図2:中空糸バイオリアクター(HFB)システムのコンポーネントとセットアップ。 リザーバーボトル(1)には、ポンプチューブ(3)に作用する蠕動ポンプ(図示せず)の作用によりバイオリアクターカートリッジ(2)を循環する完全な媒体が含まれています。細胞は、ECS側の左ポート(4)と右ポート(5)を介して細胞外毛細血管腔(ECS)に導入されます。ECSスライドクランプを閉じると、左側(6)と右側(7)の端側ポートが開き、媒体がシステム全体を循環できるようになります。ミディアムボトルのリザーバーキャップ近くのルアーロック接続部にワックスフィルムを追加して、潜在的な汚染を防ぐことに注意してください。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:NK-EVの絶縁プロセスの概略図。 EVに富む馴化培地(CM)を毎日収集した後、溶液を分画的に遠心分離して細胞(最初のスピン、300 x g で5分間)および細胞破片(2回目のスピン、2000 x g で10分間)を除去しました。クリアされたEVリッチCMは、さらなる処理まで-80°Cで保存しました。NK-EV単離の準備ができたら、凍結したEVリッチCMを解凍し、もう一度遠心分離して細胞の破片を確実に除去します(10,000 x g で30分間の3回目のスピン)。次に、EVに富むCMをエンドヌクレアーゼで37°Cで2〜4時間処理し、宿主細胞の汚染物質と見なされる核酸を消化します。次に、EVリッチCMをFast Protein Liquid Chromatography-based size-exclusion chromatography(FPLC-SEC)で処理し、バイモーダル樹脂を用いたEV精製を行います。溶出した約10〜15mLの画分を組み合わせ、0.22 μMフィルターでろ過して、最終的なNK-EV製品の無菌性を確保します。限外ろ過により、製品を約35〜50倍に濃縮することができ、1 x 1012 EV/mLを超える濃度が保証され、合計1.0〜1.5mLになります。この図は7(Biorender.com で作成)から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

2. FPLC-SECによるNK-EV精製とUFおよびフィルター滅菌の組み合わせ

  1. 次の溶液を調製し、0.1 μmフィルター( 材料表を参照)を使用して2回ろ過します:水(導電率0 mS/cm)、PBS:50 mLの10x PBS+450 mLの水(導電率約14.7 mS/cm)、20%エタノール、洗浄液(0.5 M NaOHおよび30%イソプロピルアルコール水溶液)。
  2. FPLCシステムの開始は、製造元の指示に従って行ってください( 資料の表を参照)。メーカーの指示に従って、実行前および実行後の定置洗浄(CIP)手順を実行します。すべてのラインとカラムレジンを洗浄し、二重ろ過(DF)水、洗浄液、DF水、およびDF-PBSを使用してすすぎます。
    注:CIPは必要に応じて別の日に行うことができることに注意してください。
  3. ベッドの高さが20 cmのバイモーダル樹脂( 材料表を参照)を充填したクロマトグラフィーカラムを使用します。ドリップ・トゥ・ドリップ方式で接続し、カラム内に空気が入らないようにします。
  4. 適切なコレクションチューブを使用してフラクションコレクターをセットアップし、フラクショネーション設定を目的のコレクション容量(15 mLなど)に変更します。サンプルの全量を収集するために、十分なチューブと2つの追加のチューブを配置します。
  5. 以下に説明するようにサンプル調製を実施します。
    1. -80°Cの冷凍庫から40〜80mLのEVリッチCMを取り出し、37°Cで迅速に解凍します。 サンプルを超遠心分離機にロードし、10,000 x g で4°Cで30分間遠心します。
      注意: チューブは、体積ではなく重量で正確にバランスをとる必要があります。
    2. 紡糸後、上清を回収し、新しいチューブに移します。dsDNAレベルを下げるには、EVリッチCMを50 U/mLのエンドヌクレアーゼと1.5 mMのMgCl2 で処理します( 材料の表を参照)。インキュベーター(37°C)で2〜4時間インキュベートし、適度な混合を可能にします。
  6. システム(ラインとカラム)でEV分離の準備ができたら、EVリッチCMを60 mLシリンジにロードし、サンプルラインに接続します。 [Manual Run ] をクリックしてシステムを起動し、流量を 0 に設定します。ソフトウェアの指示に従って実行をプリエンプティブに保存し、[ 開始]をクリックします。
  7. ラインB(DF-PBS)を選択し、流速150cm/h(流速2.0mL/min)で運転します。ソリューションが列を貫通していることを確認します。
  8. 導電率が安定したら、オートゼロUVを押します。流路を変更して、サンプルをカラムの前の廃液ボトルに導きます。システムに気泡が入っていないことを確認してください。
  9. 最大5〜20秒後、サンプルをカラムに向けます。UV測定値が約230 mAUに達したら 、[Fractionation ]をクリックします。
  10. サンプルがシステムを介して完全に注入されたら、バッファーシステムをDF-PBS(サンプルバルブ)に切り替えて精製を続行します。UV 値が約 1600 mAU に達したら、 再度「分画」 をクリックします。
    注:これは、UV測定値と導電率測定値の交差に対応します。分画時間が長いと、EVの収率を増加させることなく、保持物が希釈されるだけです。
  11. すべてのフラクション(希釈したNK-EV)を組み合わせ、フィルターベースの滅菌と限外ろ過(UF)の準備が整うまで4°Cで保存します。
  12. UV値が約1000mAUに達するまで、DF-PBSを続けます。その後、実行を停止し、クロマトグラムをPDFドキュメントとして保存します。

3. NK-EV製品フィルターによるUFによる滅菌・濃縮

  1. 遠心分離機を10°Cに冷却します。 UF装置のすべてのコンポーネント( 材料の表を参照)を20〜30mLの90%エタノールですすいで消毒します。4000 x g で5〜10分間回転します。
    注:フィルターは10 kDa MWCO再生セルロースでできています。
  2. 流れを捨ててから、滅菌PBSを使用してすすぎを繰り返し、デバイスを平衡化します。合計2回繰り返します。
  3. 無菌性を最大限に高めるには、DF-PBSでプレウェットした0.22 μmシリンジフィルターを使用して、希釈したNK-EV溶液をろ過します( 材料の表を参照)。濾液を直接滅菌した濃縮装置に集めます。
  4. 4000 x g で15〜40分間スピンします(スピン時間はサンプルによって異なります)。遠心後、血清学的ピペットを使用して上部フィルターコンパートメント内で溶液を混合します。4000 x g でさらに10分間回転させます。
    注:混合ステップは、EVによるメンブレンの詰まりを防ぐことにより、濃縮ステップを容易にするだけであるため、オプションです。
  5. フロースルーを一旦脇に置き、ろ過装置を反転させて回収装置に取り付けてNK-EV試料を採取します。
  6. 2000 x g で2分間遠心します。精製したNK-EV製品を2mLチューブに移します。精製したNK-EV製品は、短期使用の場合は4°C(≤7日間)で、長期使用の場合は-20°Cで冷凍保存してください。

4. ナノ粒子トラッキング解析(NTA)によるNK-EV評価

  1. 溶液を調製し、0.1 μmで2回ろ過します( 材料の表を参照):水、PBS、洗浄液(水中の10%漂白剤(注意))。
  2. 製造元の指示に従ってNTAシステムを起動します。同様に、実行前と実行後の定置洗浄 (CIP) 手順を実行します。すべてのラインを洗浄し、二重ろ過(DF)水、洗浄液、およびDF水を使用してすすぎます。DF-PBSを使用してラインを平衡化します。
  3. フローセルを確認し、気泡がないか確認します。気泡がある場合はそれを取り除きます。クリアしたら、フローセルをNTA装置に慎重に再挿入します。
    注:メーカーが推奨していませんが、非常に除去が困難な気泡は、20%エタノールですすいでからDF水ですすぐことで簡単に取り除くことができます。
  4. フローセルが配置され、ドアが閉じられたら、[ カメラの開始] をクリックします。線がDF-PBSで埋められていると、画面には絶対的な最小数のパーティクルが表示されます。
  5. キャプチャ設定を画面ゲイン 2 とカメラ レベル 14 に変更します。また、ヒーターをオンにして、フローセルの温度を安定させます。
  6. [Standard measurement] をクリックして、[SOP] タブでスクリプトを作成し、30 particles/frame の流速と 23 °C で 1 分間にわたって 1 つのキャプチャを収集します。
  7. そのすぐ下に、フォルダ名とファイル名をパス名に追加して、データを保存します。
  8. 精製したNK-EV製品をあらかじめDF-PBSで希釈液を調製してください。NTAを実行する場合、正確な定量には30〜80粒子/フレームが必要です。
  9. サンプルをシリンジにロードする前にボルテックスします( 材料の表を参照)。
  10. 1 mL取得シリンジを装置ローディングラインに慎重に接続します。空気は、取得と分析に悪影響を与えるため、存在させないでください。サンプルの半分をゆっくりと押し込み、シリンジに約0.5 mLを残します。
  11. パーティクルが画面に表示されたら、各パーティクルの周囲に最大1つのハローを持つようにカメラの焦点を合わせます。[ハードウェア] タブの [インフューズ ] を 1000 のレートで 5 秒間クリックします。次に、レートを 30 に下げます。
  12. [Run Script] を押し、画面の指示に従います。ソフトウェアは、温度が設定されていることを確認し、設定が正しいかどうかを尋ねます。[はい]をクリックし、ソフトウェアの指示に従います。
  13. キャプチャが完了したら、ソフトウェアがファイルの処理またはエクスポートを求めたら、[ キャンセル] をクリックします。[ハードウェア] タブの下にある [インフューズ ] を 1000 の速度で 10 から 15 秒間クリックします。その間に、ヒーターとカメラの電源を入れ直してください。次に、粒子が移動するまでレートを 30 に下げます。
  14. 前の手順を繰り返して、さらに 4 つのキャプチャを収集します。希釈ごとに合計5つのキャプチャが記録されたら、5つのキャプチャをすべてインポートした後で分析を実行します。
  15. 処理するファイルを強調表示して選択します。[ 選択したファイルを処理] をクリックします。[プロセス]タブで、解析設定を画面ゲイン2、検出しきい値15に調整します。
    設定はサンプルに依存します。フレームあたり 30 から 80 個のパーティクルが表示されていることを確認します。
  16. チェックを入れて [OK ] をクリックし、分析します。
  17. ファイルが処理されると、ソフトウェアはそれらをエクスポートするように求めます。追加のボックスをクリックせずに 「はい 」をクリックするか、「 エクスポート」をクリックします。
  18. すべてのEV希釈液またはサンプルについて繰り返します。すべてのサンプルが完了し、CIPが完了したら、NTA装置をシャットダウンします。

5.品質保証試験

  1. 1)精製したNK-EVの少量分量をオートクレーブしたLBブロス培地にスパイクし、2)精製したNK-EVの少量分量をマイコプラズマPCR検出に用いる( 材料表参照)の2つの試験を用いて微生物試験を実施します。
    1. 試験1:LB培地を37°Cで最大5日間培養し、ポジティブコントロールとネガティブコントロールを含めます。必要に応じて、OD600 を記録します。
    2. テスト2:メーカーのプロトコルに従ってマイコプラズマPCR検出を行います。
  2. 精製したNK-EV希釈液上のタンパク質とdsDNAを、製造元の指示に従って蛍光光度計ベースのアッセイを用いて定量します( 材料表を参照)。

6. 検証済みの高感度レサズリン系細胞生存率アッセイを用いたNK-EV処理がん細胞の効力評価 20

  1. RPMI-1640を使用してヒトK562白血病細胞を10%熱不活化FBSで数日間培養してから、力価アッセイを実施します( 資料表を参照)。密度を2〜8 x 105 細胞/mLに維持し、2〜3日ごとに培地を交換してください。
  2. 96ウェル平底プレート( 材料表を参照)を取得し、標準化に必要なアッセイ培地(5%EV枯渇FBSを添加)を事前に追加します( 材料表を参照)。最終容量は150μL/ウェルです。
    注:リピーターピペッターを使用して、ウェル間のばらつきを減らします。
  3. 細胞培養物を取得し、細胞をチューブに移します。300 x g で5分間遠心します。2〜5 mLのアッセイ培地を使用して、細胞ペレットをシングルセル溶液に再懸濁します。
  4. 自動セルカウンターで細胞カウントするために、20.5 μLの細胞懸濁液を回収します( 材料の表を参照)。
  5. 20.5 μLの細胞懸濁液分注に、同量のAO/PI色素( 材料表を参照)を加え、少なくとも10倍に混ぜ合わせます。
    注:正確な細胞計数のためにAO/PIをお勧めします。または、手動でカウントするために血球計算盤を使用します。
  6. カウントスライドの各カウントチャンバーに20μLをロードし、適切なプログラムを使用して自動セルカウントを実行します。生細胞濃度を平均化し、生存率を記録します。
  7. 約1 x 106 細胞を二次チューブに移します。細胞を正確に7 mLのアッセイ培地に希釈し、細胞カウントを繰り返します。濃度は約1.2〜1.5 x 105生細胞/ mLである必要があります。
  8. 上記のように、シングルセル懸濁液濃度を1 x 105 生細胞/mLに調整し、必要に応じて細胞カウントを繰り返します。
    注: 技術的な重複カウント間の変動係数は 25% 未満である必要があります。通常、AO/PIカウントでは5%未満です。
  9. 所望の濃度に達したら、この溶液の50μL(± 1 μL)を各ウェルに移し、5000細胞/ウェル(4900 - 5100細胞/ウェル)にできるだけ近づけます。各アッセイ条件に対してテクニカルトリプリケートを調製し、リピーターピペッターを使用してウェル間のばらつきを減らします。
  10. プレートをオービタルシェーカー(350 - 500 RPM)に2分間移します。NK-EV処理を進める準備ができるまで、細胞をインキュベーターに戻します。
  11. アッセイ培地を用いて、必要なNK-EV希釈液(1:5、1:10、1:100)を調製します。
  12. これらの希釈液から、1 x 108、5 x 108、1 x 109、5 x 109、1 x 1010、1 x 1010 、1 x10 11 粒子/mL の EV 濃度を試験します。投与量は、全アッセイ量の20%に制限されています。
  13. 準備ができたら、必要な希釈液の量を、処理に必要なEV濃度が必要なウェルに移します。15 μL の 10x Triton-X をポジティブコントロールウェルに加えます ( 材料表を参照)。最終的なウェル容量は 150 μL に正規化する必要があります。
  14. プレートをオービタルシェーカー(350 - 500 RPM)に2分間加えます。細胞を37°Cの5%CO2 インキュベーターで3時間インキュベートします。
  15. プレートリーダー( 材料表を参照)を37°Cで予温し、次のスクリプトをロードします:37°C(温度関連の変動を低減)、450 RPMで1分間混合(サンプルの均質性を確保)、読み取ります。
  16. 各ウェルに15 μLのレサズリンベースの試薬を添加します( 材料表を参照)。試薬を光から保護し、リピーターピペッターを使用してウェル間のばらつきを減らします。
  17. プレートをオービタルシェーカー(350 - 500 RPM)に2分間加えます。プレートをインキュベーターに移し、60分間インキュベートします。エタノールに浸したピペットチップを使用して気泡を取り除きます。励起560nm、蛍光590nmでプレートを読み取ります。
  18. データ分析:平均テクニカルレプリケートを平均化し、バックグラウンドを補正してから、阻害効果の非線形回帰を使用して用量反応分析を行い、制約なしのlog(阻害剤)対正規化応答変数の傾きを示しました。Hillslope と EC50 の値を記録します。

結果

NK-EVは固有の細胞傷害機能を有しており、様々ながんモデルに対して高い有効性を示しています。しかし、NK-EVの大規模生産に適したバイオマニュファクチャリングワークフローについては、現在の研究の中でさらに標準化する必要があります6,21。私たちの以前の研究では、閉ループ中空糸バイオリアクター(HFB)システムが高純度のNK-EV製品を大量に生産する可能性について説明しました7。フォローアップとして、このプロトコルベースの研究では、バイオマニュファクチャリングワークフローを詳しく説明し、NK-EV製品を製造および単離することでその再現性を実証します(図1)。さらに、製品のリリース前には、製品の特性評価と検証が必要であり、この研究では新しいオリジナルのデータを提示します。

HFBシステムは、その使いやすさ、信頼性、スケーラビリティ、およびGMPコンプライアンスにより、NK-EVの生産に選択されました7。HFBシステムのセットアップを参照して、NK細胞は左側のECSポートから注入され、バイオリアクターカートリッジに播種されます(図2)。同時に、メディアボトルはサイドポートを介してHFBに接続され、メディアはシステム全体に流れることができます。NK細胞は、無血清、ゼノフリー、フィーダーフリー、抗生物質フリーの培地で培養され、グルコース含量が50%を下回ると培地が交換され、細胞の健康を長期にわたって維持および最大化します。CMは毎日収集され、示差遠心分離機で処理され、次の処理の準備が整うまで凍結(-80°C)されます。その後、EVの分離は、示差遠心分離機とFPLC-SECの組み合わせ、UFおよびろ過の組み合わせによって行われます(図3)。これにより、最終容量が約1.0〜1.5mLの濃縮された無菌NK-EV製品が得られます。NK-EVのFPLC-SEC単離の代表的なクロマトグラムを提供します(図4)。FPLC-SEC処理の前に、NK-EVに富むCMをエンドヌクレアーゼで処理し、潜在的な宿主(NK)細胞汚染物質であるdsDNAレベルを大幅に低下させます7。したがって、説明したEV単離ワークフローは、NK-EV製品から細胞の破片とRNA/DNA汚染物質を除去し、これは低く望ましくない免疫原性を確保し、最終製品が下流の研究に適しているために不可欠です。

figure-results-1395
図4:Fast Protein Liquid Chromatography size Exclusion中に生成されたNK-EV単離クロマトグラム。 青い線は吸光度(mAU、最大読み取り値は2000 mAU)、赤い線は導電率、赤いテキストはランログ、灰色の影付きの領域は分画されたNK-EV(分数T2〜T7で表される)を表しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

分離後、基本的なNK-EVの特性評価と品質保証試験を使用して、NK-EV製品をさらなる下流実験にリリースできるかどうかを評価します。NK-EV製品の粒度範囲と濃度は、ナノ粒子追跡分析(NTA)を使用して測定され、直径76.30〜174.30nm(D10は78.38 ± 2.07 nm、D50は106.72 ± 2.43 nm、D90は169.80 ± 4.17 nm)、平均濃度は1.39 x10 12 EV / mL(図5A-B)の範囲です。).さらに、蛍光光度計の定量では、最終製品でタンパク質濃度が 298.90 ± 66.62 mg/mL と 225.60 ± 37.7 ng/mL の dsDNA 濃度が示されました(図 5C-D)。これは、タンパク質が5.06 x 106 EV/μg、DNAが6.16 x 1012 EV/μgの平均比率に相当します。微生物検査とマイコプラズマ検査の両方で陰性の結果が出ました(データは示されていません)。これらの結果は、先行研究7のNK-EVの特性評価と一致している。また、先に発表した論文7では、MISEVガイドライン(TEM、ウェスタンブロット、エンドトキシンレベル、ウイルスエンティティ、表面抗原やサイトカインのフローサイトメトリー)に従ったNK-EV製品の詳細な特性評価も行っています。

最後に、NK-EV製品の機能性(すなわち、がん細胞に対する細胞毒性)は、白血病細胞株K562 7,20に対するNK-EV治療後の検証済みの高感度レサズリンベースの細胞生存率アッセイを使用して評価されました。K562細胞をNK-EVで3時間処理すると、EC50が9.33 x 109 EVs/mL(すなわち、細胞集団の50%を殺すことに相当する投与量;図6A-B)。したがって、概説された製品のリリース基準に従って、NK-EV製品はさらなる実験に適していると見なされます。

figure-results-3092
図5:精製されたNK-EV製品の特性評価 (A)NTAによって測定されたNK-EV製品サイズ分布は、それぞれが10回の技術的反復(5回のビデオキャプチャ×2希釈)を持つ5つの独立した実験からの平均として示されています。(B)NTAによって測定されたNK-EV粒子生成物濃度(粒子/ mL)は、5つの独立した実験からSD±平均として示され、それぞれに技術的な重複があります。(C)NK-EV産物のタンパク質濃度(mg / mL)は、5つの独立した実験から平均±SDとして示された蛍光光度計を使用して測定されました。(D)蛍光光度計を使用して測定したNK-EV産物のdsDNA濃度(ng / mL)は、5つの独立した実験からSD±平均として示され、それぞれに技術的なトリプリケートがあります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図6:精製NK-EV製品の機能検証。 NK-EVは、高感度のレサズリンベースの細胞生存率アッセイを用いて、さまざまなNK-EV濃度で3時間処理したヒトK562白血病細胞に対して用量依存的な細胞毒性を示します。(A)正規化されたアッセイの読み出し(緑の線は未処理のK562白血病細胞コントロール、黒の破線は溶解したK562白血病死細胞コントロール、界面活性剤処理)を示します。データは、テクニカルトリプリケートを用いた11の独立した実験からの平均±SEMとして示されています。(B)95%信頼区間/予測バンドを使用したNK-EV治療の可変傾きを使用したEC50 曲線分析(赤い破線は50%の応答を表します)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

いくつかの研究は、NK-EVが抗がん剤として大きな可能性を秘めていることを示唆しています4,5,7,9,16,22,23,24,25,26,27,28,29,30 .しかし、高純度のNK-EVを大量に生産できるスケーラブルなGMP準拠のバイオ製造システムは、さらなる前臨床試験や将来の臨床応用のために必要とされています。この問題を解決するために、以前の研究では、クローズドループHFBシステムを使用してNK細胞を連続的に作製し、下流の実験に適したNK-EVリッチCMを使用しました。その3D設計により、HFBシステムは血管系の状態を密接に反映し、非常に高い表面積対体積比を持ち、10億個以上の細胞を培養に残すことを可能にし、最終的にはEV生産の改善につながります7,31,32。重要なことに、この研究は、おそらく細胞株IL-2の自給自足性によるNK細胞の培養にHFBシステムを使用したことを初めて報告した研究でした7。

HFBシステムの無菌性を確保し、高純度のNK-EVを製造するためには、さらなる措置を講じる必要があります。これらの予防措置は、いくつかの研究施設に当てはまる可能性のある無菌のクリーンルームがない場合に特に重要です。バイオセーフティキャビネットに入る前に、HFBシステムに70%のエタノールを細心の注意を払って噴霧し、すべての外部表面を消毒します。さらに、ワックスフィルムはすべてのルアーロック接続部に巻き付けられており、汚染のリスクを最小限に抑えます。このバイオマニュファクチャリングワークフローは、細胞および細胞由来製品の生化学的プロファイルに影響を与えることが知られている抗生物質を使用しないため、これは特に重要である33。細胞製品のバイオ製造中に細胞の健康状態を評価するために、さまざまな指標が使用されました。例えば、リザーバー培地のpH、グルコース、乳酸レベルは、モニタリングのための重要な細胞の健康代理であるため、毎日評価が行われました。定量的評価に加えて、HFBシステムの定性的観察(例えば、培地の色や濁度などの汚染の視覚的兆候)も、細胞の健康状態のモニタリングに役立ちます。毎日検索されるCMの細胞数は、培養の健康状態に対する生存率の代表的な指標であることはわかっていません(データは示されていません)。これは、CMサンプリング中に回収された死細胞が、培地の循環が許可されていないチューブ内(ECSとECSシリンジポートの間の小さな部分)で見つかったため、細胞培養全体の生存率が過小評価された結果である可能性があります。生産ロットの終了時にHFBによって産生された回収されたNK細胞のみが、培養の健康状態の信頼できる指標を提供できます。これらの細胞は、生産ロット7全体で一貫して70%を超える生存率を示しました。これらの品質評価方法を組み合わせることで、高純度のNK-EVの連続生産が保証されます。

EVを精製し、隔離するために、いくつかの隔離技術が開発されてきた34。SECの1つの方法は、多孔質材料(樹脂)を充填したカラムを利用し、サイズ識別に基づく分子分離を可能にします。ここでは、大型のEVがカラムからより速く溶出されます。この方法は、サイズ排除に基づくフロースルー精製として知られています。同時に、より小さな汚染物質(dsDNA、エンドヌクレアーゼなどの浮遊タンパク質、塩、フェノールレッドなど)が残され、静電気力によって樹脂内にさらに保持されます(つまり、バイモーダル樹脂が使用されました)。SECベースのプロセシングは、元のEVの構造と機能を維持しながら、非EV結合タンパク質を除去する35,36。さらに、SECベースの精製は、高い収率と純度を損なうことなく容易に拡張できるため、バイオ医薬品用途のNK-EVの単離に適した選択肢となっています。これらの利点にもかかわらず、SECには、比較的希薄なフロースルー(溶離液)など、いくつかの欠点があります。したがって、UFは製品の濃縮に必要ですが、バッファー交換も可能にします。非滅菌UF装置は、70%エタノールとPBSですすぎ、使用前にバイオセーフティキャビネットに保管して無菌性を確保します。通常、フロースルーは初期体積の35倍から50倍まで濃縮でき、溶離液に侵入する可能性のある小分子は除去されます。FPLC-SECとUFを併用する前に、分画遠心分離とエンドヌクレアーゼ処理を行い、残留細胞、細胞残骸、および抗原性dsDNAの長い鎖を除去します7。

NK-EV製品の分離に続いて、MISEV2018およびMISEV2023のガイドラインに従って特性評価と機能検証が行われ、製品のさらなる使用に対する適合性が判断されます6,18。各単離により、1 x 1012 EVs/mL の最小濃度で 1.0 〜 1.5 mL の高純度 NK-EV 製品が得られ、平均濃度は 1.39 x 1012 particles/mL です。以前、Guptaらは、インビボでのEV投与量の中央値は、マウスの体重3.37×108 EV/kgであると決定した37。中央値での治療には、体重25gの8.43 x 106 EV/マウスが必要ですが、これはこのワークフローで得られる保証された最小値(1 x 1012粒子/mL)をはるかに下回る値です。したがって、上述のバイオマニュファクチャリングワークフローは、前臨床試験や投与目標を達成するために、十分なNK-EVを生産することができます。各単離物は、製品の品質管理評価の一環として、マイコプラズマと微生物の存在について試験されます。さらに、以前の研究では、最終製品に共通のウイルス実体とエンドトキシンが存在しないこと、および宿主細胞の汚染物質と見なされる細胞成分が存在しないことが示されました（ウェスタンブロット分析による）7,34。最後に、NK-EVの機能を評価するために、検証済みの高感度レサズリンベースの細胞生存率アッセイを使用して機能評価を行いました20。記載されている生存率アッセイは、代謝活性細胞によってレサズリン(弱蛍光)をレゾルフィン(高蛍光)に還元することで機能し、NK-EV治療後の細胞生存率の評価を可能にします。他の代替細胞生存率アッセイと比較して、この研究で使用されたレサズリンベースのアッセイは、細胞生存率の変化に対して非常に敏感であり(非常に低いバックグラウンドノイズ)、結果を観察するためのインキュベーション時間を短縮することができます(統計的に有意な結果を得るのに30分未満)20。一般に、NK-EVはK562の生存率に用量依存的な影響を及ぼします。これらの結果をまとめると、前臨床評価の製品リリース基準を満たし、ダウンストリームアプリケーションに適したNK-EV製品であることが示されました。

結論として、このプロトコルベースの研究では、臨床グレードの可能性を秘めたNK-EVのバイオマニュファクチャリングについて説明しています。前述したように、NK-EVは、無血清、ゼノフリー、フィーダーフリー、および抗生物質フリーの条件下で、閉ループHFBシステムを使用して製造される7。FPLC-SEC/UFの組み合わせにより、NK-EV製品を分離・精製します。製品をダウンストリームアプリケーションにリリースする前に、NK-EVの特性評価と機能検証を行い、使用に適していることを確認する必要があります。実証されているように、このバイオマニュファクチャリングプロトコルに従うことで、がん細胞に対してオンターゲット細胞毒性を示す高純度のNK-EVを大量に生成することに成功します。したがって、記載されているバイオ製造プロトコルは、臨床グレードのNK-EVの製造を必要とする将来の研究の資産となる可能性があります。

開示事項

すべての著者は、利益相反または開示を行わないことを宣言します。

謝辞

著者らは、Simon Sauvé博士、Roger Tam博士、Xu Zhang博士の批判的原稿レビューに感謝します。この研究は、JRL、LWが取得したカナダ政府のGenomics Research and Development Initiative(GRDI)Phase VII(2019-2025)からの運営助成金、および自然科学および工学研究評議会RGPIN-2019-05220、Cancer Research Society/University of Ottawa 24064、LWが取得したカナダ衛生研究所(CIHR)研究運営助成金175177からの運営助成金によって支援されました。 MKが取得したCIHR MSc奨学金、およびFSDBが取得したエリザベス2世女王科学技術奨学金(QEII-GSST)。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1 µm vacuum filtration unit Filtropur V50 Sarstedt83,3941,002
0.22 µm Acrodisc Syringe Filter Pall CorporationPN4612
1 mL syringe Thermo Fisher ScientificMB9204560TF-LAB
10 kDa Centricon Plus-70 Centrifugal FilterSigmaUFC701008
60 mL syringe BD Biosciences309653
96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-treated Microplates Costar3603
Agarose Thermo Fisher ScientificR0491
AKTA Fast Protein Liquid Chromatograph GE Lifesciences29022094
BD PrecisionGlide Needle - 18GBD Biosciences305196
Benzonase Nuclease SigmaE1014-25KU
BioTek Synergy H1 Multimode ReaderBioTek SH1M2G-SN
Blue Juice Gel Loading Buffer Invitrogen10816015
CaptoCore 700 resin Cytiva17548102
Cellometer Auto 2000 Viability Counter Nexcelom BioScience LLC
CryoStor CS10 freezing medium SigmaC2874
DPBS−/− FisherBP399-1
Dual LED Blue/White Light Transilluminator InvitrogenLB0100
Duet P3202 Flow Control Pump FiberCell Systems
Dulbecco's phosphate-buffered salineGibco14190250
Ethanol Commercial AlcoholsP006EAAN
Exosome-Depleted FBS GibcoA2720803
Fluorobrite DMEM GibcoA18967-01
Glucose meterAccuCheckModel 930
HiScale chromatography column 10/40 Cytiva29360550
ImmunoCult-XF (GMP medium alternative)StemCell Technologies100-0956
ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium StemCell Technologies10981
Isopropyl Alcohol EMDPX1834-1
K562 cellsATCCCCL-243
LB media BioBasicSD7002
L-Lactate Assay Kit Abcamab65331
Medium hollow-fibre cartridge FiberCell SystemsC2011
MgCl2 SigmaM1028
Mycoplasma PCR detection kit Abcamab289834
NanoSight NS300 Malvern
NaOH SupelcoSX0607N-6
NK92-MI cells ATCCCRL-2408
pH Strips-Mquant Sigma1,09533
PrestoBlue HS Cell Viability Reagent Assay InvitrogenP50200
Qubit 4 Fluorometer Invitrogen
Qubit dsDNA BR Assay KitInvitrogenQ33262
Qubit dsDNA HS Assay KitInvitrogenQ33231 
Qubit Flex Assay Tube Strips InvitrogenQ33252
Qubit Flex Fluorometer InvitrogenQ33327
Qubit Protein BR Assay Kit InvitrogenA50669
Quick Load 1Kb Plus DNA ladder NEBN0469S
SYBRSafe DNA Gel Stain InvitrogenInvitrogenS33102
Syringe pump Harvard Apparatus984730
Triton-X 100 SigmaT-9284
UltraPure TAE Buffer Invitrogen15558042
ViaStain Acridine Orange and Propidium Iodide (AO/PI) Staining Solution ESBE ScientificCS2-0106

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