ゼブラフィッシュ幼生の発育中の骨芽細胞の2光子レーザー媒介アブレーション

要約

このプロトコルは、ゼブラフィッシュの幼生で実施される 2 光子レーザー アブレーション アプローチについて説明しており、骨再生とアブレーションに対する免疫応答の影響を研究するためのモデルとして機能します。

要約

ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、さまざまな臓器や付属肢を再生する優れた能力を持っています。ゼブラフィッシュの骨再生は、ヒレ切断、鱗摘採、頭蓋骨穿孔、顕微鏡的アプローチなど、さまざまな方法を用いて研究されてきました。2光子レーザーを搭載した共焦点レーザースキャニング装置を用いて、ゼブラフィッシュ幼生の発育中の骨形成細胞(骨芽細胞)をアブレーションする病変パラダイムとしてレーザーアブレーション法を開発しました。ここで説明する方法は、面積、形状、および深さを微調整できるため、正確な方法で細胞を切除することを可能にする。さらに、この方法では、アブレーションの前後の領域を画像化できるため、損傷の短期的な影響を分析できます。この実験装置では、損傷した領域の骨芽細胞のアブレーション後の免疫応答が研究されました。アブレーション後にマクロファージの動員の増加が観察され、骨再生中のマクロファージの存在の関連性が示されました。

概要

ゼブラフィッシュは、網膜、脳、心臓、膵臓など多様な臓器を再生します¹。さらに、ゼブラフィッシュは骨格要素を再生するため、ヒレ、鱗、カルバリア(頭蓋骨)の再生の研究に利用されてきました²。組織および骨の再生を研究するために、ひれ切除術(切断)、ひれ骨折、頭蓋骨穿孔^術3,4、凍結損傷^5,6、または遺伝的切除^7,8,9など、さまざまな実験パラダイムが使用されてきました。最近、レーザーアブレーションアプローチは、損傷後の治癒および再生応答を研究するためにゼブラフィッシュで広く使用されています10,11,12,13,14。^....

プロトコル

この研究プロトコルは、Landesdirektion Sachsenから承認を受けました。許可番号は25-5131/564/2、DD25-5131/450/4、25-5131/496/56、DD25.1-5131/354/87です。使用されたゼブラフィッシュの系統は、国内法に従って、前述の^27,28の標準化された条件下で維持されました。本試験で使用したすべての試薬および機器の詳細は、材料表に記載されています。

1. 材料と溶液の調製

1. 胚を1x E3培地で維持します。1x E3培地を調製するには、60x E3ストック170 mLを10 Lの脱イオン水で希釈し、2 mLの0.1%メチレンブルーを加えます。
   1. 17.2 gのNaCl、0.76 gのKCl、2.90 gのCaCl_2.2 H₂O、4.90 gのMgSO_4.7 H₂Oを1 Lの脱イオンオートクレーブ水に混合して、60x E3培地ストックを調製します。
2. 幼虫の包埋には、あらかじめ1%低融点アガロース(LMA)のア....

ディスカッション

レーザーアブレーションは、生物学研究のさまざまな分野で応用されてきました。特に、組織再生を研究する方法として有用であった10,11,12。例えば、自然免疫細胞の動員および表現型の変化は、最近、UVレーザーまたは2光子レーザーアブレーションアッセイを用いて経時的に解析され、レーザー.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Calcium chloride dihydrate, CaCl2·H2O	Carl Roth	5239.1
Cell Culture Dish, PS, 100/20 mm	Greiner Bio-one	664160
Dumont #55 Foceps	FST	11295-51	Tip shape straight, 11 cm, 0.05 x 0.02 mm
Falcon 6-well plate	Corning	353502
Glass-bottom microwell dish	MatTek	P35G-1.5-14-C	35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm Glass Diameter, Uncoated
Insight X3 multiphoton laser	Spectra-Physics
Leica Application Suite	LAS X, Leica Microsystems
Low melting agarose	Biozyme	840101	Biozym Plaque Agarose
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4·7H2O	Sigma-Aldrich	M5921
Mating cages			many varieties, e.g. Tecniplast
Methyleneblue	Carl Roth	A514.1
MS-222	SIGMA Aldrich	A5040
Potassium Chloride, KCl	PanReac AppliChem	131494
Sodium chloride, NaCl	Carl Roth	3957.1
SP8 FALCON	Leica Microsystems		Equipped with a Insight X3 multiphoton laser and Leica Application Suite software
Stainless Steel Dissect Needle	Bochem	12010	140 mm
Stereo Microscope System SZX16	Olympus		Equipped with a LED illumination base SZX2-ILLTQ
Thermostatic Cabinets TS - WTW	xylem	TS 608/2-i	For incubation (embryo)
Transfer pipette, 3.5 mL	SARSTEDT	861171	155 x 15 mm, LD-PE, transparent
Zeiss SteREO Discovery.V12 version 4.7.1.0.	Zeiss		Equipped with Axiocam MRm camera and AxioVision sofware