マウスにおける頭部固定型バーチャルリアリティの行動訓練法

要約

この記事では、マウスで一般的に使用される線形トラック仮想現実(VR)パラダイムの実験手順と、Y字型の信号識別タスクをテストすることにより、複雑なVRタスクを実行する可能性を決定する方法について説明します。

要約

頭部固定と組み合わせたバーチャルリアリティ(VR)は、頭部固定マウスで複雑な行動アッセイを行うことができるため、行動神経科学研究でますます利用されています。これにより、神経記録中の動きに関連する信号ノイズを最小限に抑えるために頭部固定を必要とするさまざまな神経生理学的手法を組み込みながら、正確な行動記録が可能になります。しかし、VRの使用が増加しているにもかかわらず、VRの実装方法に関する詳細な方法論に関する公開データはほとんどありません。この研究では、雄と雌のC57B16 / Jマウスが仮想線形廊下を走るように訓練され、その長さが複数の訓練セッションで1〜3 mに増加する訓練プロトコルが開発されます。この基礎に基づいて、本研究では、Y迷路パラダイムを使用してVR内で複雑な行動をとるマウスの実現可能性を調査しました。このタスクでは、Y迷路の選択ポイントから黒い壁のあるアームに移動する必要がありました。2日間連続で70%以上の正解という基準に達した後、マウスはますます困難な感覚弁別に進行しました。 この知見は、VRでのマウスの訓練を成功させるための方法論に関する重要な詳細を提供し、マウスがY迷路をナビゲートする学習能力を示すことを示している。提示された方法論は、VRベースのアッセイにおけるトレーニング期間に関する洞察を提供するだけでなく、マウスの複雑な行動を調査する可能性を強調し、より包括的な神経科学研究への道を開きます。

概要

バーチャルリアリティ課題は、頭部固定によるマウスの行動評価の強力な方法として浮上しており、これにより、自由に行動するマウス1では損なわれる機械的な安定性^{が可能になります。}この方法により、電気生理学的記録^2,3および光学イメージング^4,5,6,7における運動アーチファクトの低減が可能になります。また、反復可能な行動⁸と正確な視線追跡⁹も容易になる。実験のセットアップでは、マウスは所定の位置に固定され、空気で支えられた球形のトレッドミルの上に配置されます。この装置は、VR環境内で視覚的に誘導された行動の複雑な調査を可能にします。マウスがトレッドミル上を移動すると、その移動は仮想ランドスケープ内のナビゲーションとシームレスに同期し、マウスを囲む画面に視覚的に描かれます。

この研究の目的は、実験的行動神経科学における主要な課題に取り組むことと、この分野の方法論の進歩に貢献することの2つです。第一に、学術研究10,11,12におけるVRの使用が増加しているにもかかわらず、包括的な方法論とトレーニングプロトコルが著しく欠如しており、新しい研究者によるこの技術の採用を妨げています。主な目標は、先行研究13,14,15に示されているように、線形トラックパラダイムの詳細なトレーニングレジメンを描写することにより、このギャップを埋めることでした。市販のシステムは、これらの運用手順を説明するために使用されます。免責事項として、これらの手続きガイドラインには、このシステムに固有のコンポーネントがあります。ただし、このプロトコルの一般化可能性についての議論については、議論を参照してください。目的は、行動手順、これらの手順を実行するための一般的なタイムライン、および単純な線形トラックで実行するためのマウスのトレーニングの成功率を概説することでした。

第二に、マウスのこのパラダイム内での複雑な迷路タスクの実装に関するドキュメントが依然として不足しています。複雑な仮想アッセイがラット^{で開発されました11}。しかし、マウスはそれに比べて視力が低下しており¹⁶ 、複雑な課題¹⁷ではしばしばパフォーマンスが低下する。一部の調査では、証拠の蓄積や空間的な新規性などの特定のタスクに焦点を当てています¹⁸が、ここでの焦点は、マウスがVR環境内で意思決定パラダイムに従事するために必要なトレーニング方法論を解明することでした。この課題に対処するために、シグナル識別タスクが考案され、マウスは、Y迷路の選択ポイントで黒のアームを選択することによって達成され、各試行で正しいアームがランダム化された報酬と報酬の色/輝度(黒対白)を学習することのみを任されました。このタスクは、仮想キューとの対話を必要とし、マウスの知覚識別能力に関する洞察を提供するように設計されています。

要約すると、この研究は、マウスでVRパラダイムを使用するための包括的なトレーニングプロトコルを提供し、このフレームワーク内で複雑な意思決定タスクの方法論を解明することにより、実験的行動神経科学の分野における重大なギャップに対処します。本研究は、先行研究の知見と革新的な実験デザインを活用することで、研究の効率化と行動の根底にある神経メカニズムの理解を進めることを目的としています。次のセクションでは、実験手順と結果について深く掘り下げ、調査結果について説明します。

プロトコル

動物に関するすべての手続きは、NIEHS動物管理・使用委員会が定めたプロトコルを厳守して実施され、倫理基準と福祉ガイドラインの遵守を確保しました。この研究には、約8週齢のC57BL/6Tacマウスを使用しました。

1. ヘッドバー埋込み手術

1. 手術の準備
   1. 自分のコホートに必要な量のマウスを取得し、理想的にはヘッドバーインプラントとの干渉を最小限に抑えるために個別にマウスを収容しますが、これはオプションです¹⁹。この研究では、3匹の雄と3匹の雌マウスのサンプルサイズを使用しました(最初はバランスが取れていましたが、ボールで走らなかったため、トレーニングの早い段階で1匹の雄を除外しました)
   2. 材料表に指定されている材料を取得し、試験デザインの詳細に応じて調整します。
   3. マウスを入手したら、個々の識別子を指定し、尾の入れ墨または耳の穴のパンチを適用して、明確な識別を確保します。水制限手順に必要な重量を体系的に記録するための包括的なログを確立します。
2. 麻酔管理
   1. 適切な注射器、加熱パッド、金属製品(ピンセット、マイクロハサミ、止血器など)、ヨウ素溶液、眼用潤滑剤、生理食塩水と過酸化水素用のビーカーなど、すべての手術器具がすぐに利用できることを確認してください。無菌状態を確保するために、オートクレーブを使用してすべての手術器具を消毒し、すべての手術器具を滅菌してください。
   2. 手術を進める前に、マウスの正確な体重測定を行い、加熱パッドを34°Cにアクティブにします。 必要な情報は、所属機関の研究室・手術ノートにすべて記録してください。酸素とイソフルランタンクのレベルの妥当性を確認し、中断のない外科的処置を容易にするために必要なすべての材料の利用可能性を確認します。
   3. マウスを首筋にし、4%イソフルランと3L /分の酸素流量を投与して麻酔を誘発する小動物用に設計された気化器に取り付けられたノーズコーンに入れます。スカベンジャーを使用して、潜在的に有害な廃ガスを捕捉します(推奨)。
   4. 眼の乾燥を防ぐために、マウスの目の下にある間に石油眼科用獣医軟膏を投与します。最初に各目に1滴を塗り、必要に応じて再塗布します。定期的なチェックでこの潤滑剤の層を常に維持することにより、目の一定の保護を確保します。
   5. 頭蓋骨がヘッドバーに固定される領域を剃ることにより、マウスの頭の手術部位(図1A)を準備します。
   6. マウスの切歯をノーズコーンの下の定位固定装置内に配置して、酸素流量を1 L / minに調整し、気化器から1%〜2%のイソフルランを投与します。.弁を調整し、それに応じて誘導ノーズコーンと定位固定装置を切り替えることにより、適切な麻酔の流れを確保します。マウスの後ろ足を伸ばし、つま先にしっかりと圧力をかけます。足が反射的な離脱反応を示さない場合、これは麻酔が効果的であることを示しています。15分ごとに繰り返し、呼吸チェックを行います。
   7. マウスの頭部を外耳道内に外科用安定バーを取り付けて固定し、手術中の頭部の動きを最小限に抑えます。
   8. 切開や注射を行う前に、ヨウ素消毒剤に浸した綿棒で頭のてっぺんの剃った手術領域をこすり洗いして滅菌します。この段階からは、無菌状態を維持するために滅菌手袋を使用してください。
3. 注射投与。
   1. 0.05 mL のブピバカイン (局所鎮痛薬) を 25G の針で頭皮の外科的切開部位に皮下注射します。
   2. 肩甲骨間領域の片側に25Gの針で1mLの生理食塩水(水分補給)を皮下注射します。
   3. 0.05 mLのブプレノルフィン(全身鎮痛薬)を25Gの針で肩甲骨間領域の反対側に皮下注射します。.
4. 頭蓋骨を露出させる
   1. マイクロハサミを使用して、眉毛の隆起のすぐ上から後頭部のノッチの後ろまで伸びる、頭蓋骨の前頭間および鼻腔縫合糸の上の皮膚の切開を作成します(図1A)。
   2. 止血器を使用して皮膚の左右のフラップを押さえ、頭蓋骨を露出させます。
   3. 乾いた綿棒を使用して、ピンで留められた皮膚のひだの間の頭皮から結合組織を取り除きます。
   4. 過酸化水素で濡らした綿棒(飽和していない)を使用して頭皮をこすり洗いし、縫合糸の視認性を確保し、周囲の組織に過酸化水素が付着しないように注意してください。
   5. ステップ1.4.3と1.4.4を2倍から3倍に繰り返して、ブレグマとラムダの両方がはっきりと見えるようになり、頭皮が完全にきれいになります。
5. 外科用スクリューの埋め込み
   1. 頭蓋骨に2本のネジを取り付け、1本のネジをブレグマの後方に、もう1本のネジをラムダの前に配置し(図1B)、歯科用接着剤の表面積を最大化し、ヘッドバーの安定性を高めます。ネジの位置を、ブレグマから指定された距離にあるターゲットに配置します。1本のネジが左側に配置され、もう1本のネジが右側に配置されていることを確認し(つまり、前部-後部(AP)+1.00、内側-外側(ML)-1.00、AP -3.00、ML +3.00)、ヘッドバーの配置に対応し、座標と必要に応じて調整するために、ネジ間に十分なスペースがあることを確認します。
   2. ドリルターゲットの位置をドリルし、ドリルが頭蓋骨の骨に限定され、脳組織を貫通しないようにします。
   3. ドライバーを使用して、ネジの約半分を所定の位置にねじ込みます。2 本目のネジについても繰り返します。
6. ヘッドバーインプラントの取り付け
   1. 歯科用セメントをブレンドし、ヘッドバーの下側に投与し、凹面に焦点を当て、頭蓋骨の正面間縫合糸に沿って適用します。.
   2. ヘッドバーを前頭間縫合糸の上に配置して、ヘッドバーの歯科用セメントと縫合糸の歯科用セメントとの間の接着を容易にします。固まるまで約5分間、希望の角度で手でしっかりと固定します。必要に応じて追加の歯科用セメントを塗布します。(図1C-E)
7. ヘッドバーの上に皮膚を再度取り付ける
   1. 止血剤を放し、ピンセットを使用して、乾燥した歯科用セメント固定ヘッドバーで2つの皮膚フラップを再結合します。局所組織接着剤を使用して、頭皮の左右の部分をヘッドバーの上にゆっくりと接着することにより、皮膚を繊細に固定します。これは、前方切開部位から始まり、後部切開部位で終わります。
   2. 局所組織接着剤を硬化させて、手術領域が再密封されたことを確認してから、マウスを手術用安定バーとノーズコーンから解放します。
   3. マウスを単独で収納されたケージに移し、37.5°Cの加熱パッドに置きます。
   4. マウスが意識を取り戻すまで、マウスに不快感や呼吸の不規則性の兆候がないか注意深く監視します。マウスが胸骨の横臥位を取り戻し、警戒心を示し、歩行できるようになるまで、マウスを放置しないでください。
   5. 外科的処置の後、マウスに1週間の休息期間を経させます。マウスを毎日監視して、体重の顕著な変動を検出して対処します。手術後3日目にマウスにマッシュを提供して、回復を助けます。ヘッドバーとの干渉を防ぐために、これらのマウスを個別に収容してください。

2. 流体の制限

注:水分制限はマウスに喉の渇きの状態を誘発し、液体報酬に対するマウスの動機を高めます。しかし、マウスの健康²⁰の維持を確保するためには、細心の注意を払った実施が必要である。

1. 手術日から1週間後に、マウスのベースライン体重を設定します。
2. 小さなペトリ皿(60 mm x 15 mm)の凹面を下にしてケージの床にテープで固定し、小さなペトリ皿(35 mm x 10 mm)を床にテープで留めたペトリ皿の平面の中央まで凹状にテープで固定し、別の小さなペトリ皿(60 mm x 15 mm)を中央の皿の平らな面の上にテープで留めて貯水池として機能します(図2)。
3. 上皿の高さが寝具材料による汚染を防ぎ、マウスが水に簡単にアクセスできるようにしてください。ピペットを使用して、毎日の水許容量を貯水池に追加します。
4. 1日目に、マウスに体重100gあたり15mlの水の用量を提供します。
5. 2日目に、体重100 gあたり10 mLの水をマウスに投与します。
6. 3日目に、体重100 gあたり5 mLの水をマウスに投与します。マウスは、体重に関係なく、研究期間中、1日あたり最低1 mLの水を摂取する必要があります。
   注:研究者は、すべての被験者に最小量を均一に投与することを選択できますが、そのような調整は慎重に検討して行う必要があります。
7. 水の割り当ての研究期間中、体重 100 g あたり 5 mL で一貫した投与量を保ちます (または、必要に応じて均一な 1 mL の水の割り当て)。
   注:マウスは、マウスがVR実験を行っていないとき(つまり、週末)に週に1〜2日間、水への 自由な アクセスを提供する必要があります。これにより、自然な水分補給レベルの回復が容易になります。マウスが記録されたベースライン体重の90%を下回った場合、ベースライン体重の90%に達するまで 、 自由に水にアクセスできるように移行する必要があります。記録されたベースライン体重の80%を下回ったマウスは、倫理的に安楽死させる必要があります。
8. 実験を正確に実施するために不可欠な自然な喉の渇きの行動への潜在的な干渉を軽減するために、行動評価の少なくとも 30 分後に毎日の水量を投与するのを遅らせます。
   注:試用直後に液体の報酬を与えると、マウスはすぐに報酬を受け取ることを期待し、タスクの関与が損なわれる可能性があるため、マウスのパフォーマンスに不注意に影響を与える可能性があります。したがって、試験後の水へのアクセスを遅らせることで、即時の報酬供給への慣れを防ぎ、実験セットアップの完全性を維持します。

3. システムのセットアップ

1. 機器への理解: VR 動作システムのハードウェア コンポーネントとその他の考慮事項については、以下の手順を参照してください。
   同等のシステムセットアップに対するプロトコルの一般化可能性の検討については、ディスカッションセクションを参照。
   1. 完全に没入型の仮想ディスプレイまたはドーム:この仮想ディスプレイは、カスタマイズ可能な仮想環境内で動物に完全な没入感を提供します。仮想環境内の動きは、球形のトレッドミル上の動きと同期します。
   2. 液体報酬システム:液体報酬システムは、タスクが正常に実行されると、マウスに伸びるプラスチックコーティングされた金属チューブを介して報酬溶液を誘導する蠕動ポンプを使用して液体強化(水または砂糖水)を送達することで機能します。これには、試用期間中にマウスが獲得した報酬の量を監視するセンサーが含まれています。
      1. 報酬チューブは、エチルアルコールまたは代替の洗浄剤を使用して毎週清掃してください。これを行うには、液体報酬の送達と同様に、チューブを通して2〜5 mLの洗浄剤をフラッシュし、その後、等量の水で同等のフラッシュを行います。
      2. 実験を開始するときは、報酬チューブを指定された時間アクティブにし、分配された液体の量を測定することにより、報酬チューブからの液体報酬の分配速度を決定します。この手順により、蠕動ポンプの液体供給速度を決定できます。この調査では、約0.0083 mL/sの分注速度を使用しました。
         注:ほとんどのシステムでは、行動の実行から報酬の放出までの期間にプログラム可能な設定が提供されており、試行ごとの意図された報酬量に基づいて研究プロトコルを正確に計画することができます。使用された量は、マウスが報酬を消費するのに十分な時間を確保し、その量がやる気を起こさせるように見えたため、十分であると判断されました。
      3. 一部のプロトコルでは、報酬の配信を開始するために、マウスが報酬の注ぎ口をなめる必要がある場合があります。ここで採用されたタスクのタイプについては、この機能は採用されておらず、目的の動作(つまり、y-迷路で正しいアームを選択する)の成功のみに伴って報酬を提供します。これにより、舐める傾向が十分に確立されておらず、最初の舐めが発生しにくくなるトレーニングの早い段階での失敗を回避できます。また、報酬期待の測定も可能であり、これは、ある条件下では航行性能から切り離される¹¹。
      4. 体液制限を使用する一部の実験では、報酬管を介して標準的な水を使用することを選択しますが、ここでは、オペラントパラダイム内の追加の動機付け刺激として砂糖水(10%ショ糖v / v)を使用します。特に、砂糖水の導入により、複数の実験コホートにわたるパフォーマンスの向上が観察されました。
   3. 発泡スチロールボール:このボールは球形のトレッドミルとして機能します。下から空気でクッション性を持たせたら、マウスがボールの上を快適に走ったり歩いたりするように訓練します。距離と速度に関するデータを収集するモーショントラッキングセンサーを備えたボールホルダーの上に置きます。
   4. ヘッドホルダー:デバイスをマウスの後方に配置し、ヘッドバーをホルダーに取り付けたときにVRディスプレイと視覚的に位置合わせされるようにします。この装置は、マウスを頭に固定位置に維持するために重要であり、特に光学イメージングや電気生理学的技術と併用する場合に、運動アーチファクトを軽減します。
   5. エアフローハードウェア:圧縮空気源からボールへのエアフローを構成して、ボールの上を走るマウスを助長する無重力環境を作り出します。このセットアップでは、ボールに加えられる空気圧を正確に制御するためのフローレギュレーターが必要です。ボールは、最小限の空気供給で無重力環境内で効率的に動作します。したがって、システムのセットアップ中に、ホルダー内のボールのスムーズで妨げられない動きを促進するために必要な最小限の空気量を確認してください。10〜20 L / minの流量が推奨されます。
2. ソフトウェアのセットアップ:システムの操作に関する具体的な詳細については、以下を参照してください。
   注:ビデオゲーム²¹の設計とほぼ同じように、仮想世界のアーキテクチャは、外部コントローラ、プログラム可能なナビゲート可能な環境、および動的機能を示す状態図を含むスケジュールファイルなどの主要な要素を統合している。これらのコンポーネントは相乗的に収束し、調査研究に従事する被験者にとってまとまりのあるインタラクティブな体験を作り上げます。ソフトウェアの運用効率は、指定されたフォルダ内の正確なファイル編成に依存します。この説明では、既成のテンプレートを作成するために必要な主な手順を概説し、既存のファイルを簡単に調整して新しいバージョンとして保存できるようにします。これらの新しいバージョンは、その後、研究の基礎を形成します。
   1. 次の 3 つのファイルを一緒に使用して、運用可能な仮想ランドスケープを構成します。
      1. XMLファイル:このファイル形式は、空、床、壁などのさまざまな要素の写真テクスチャを操作する機能をユーザーに提供します。画像に使用したファイルを VR フォルダーの Data サブフォルダーに配置します。これらを使用して、迷路の寸法を指定し、迷路内のマウスの初期位置を決定します。これらのファイルを使用して、迷路内の特定のノードで3Dオブジェクト(視覚的な手がかり)を定義します。これらのファイルは、テキストエディタを使用して変更します。
      2. XLSX ファイル: これらは、3 つのファイルの種類 (XML、XLSX、XAML) をすべて構成して、まとまりのある対話型の仮想プレゼンテーションを形成するコマンド ファイルとして機能します。これらのファイルを使用して、ゲイン感度、抽出するデータ、実験のためにグループ化するファイルなど、VR とそのアクセサリを実行する実験ルーチンを定義します。
      3. XAMLファイル:ソフトウェアアプリケーションは、フローチャートを利用して実験スケジュールを作成するためのグラフィカルインターフェイスを提供します。これにより、試行の時間パラメータの定義、試行完了後のテレポーテーションの制御、および試行フレームワーク内のデジタル出力のアクティブ化タイミングが容易になります。
   2. システムの動作中にデータを取得し、システムをユーザー制御するには、次のアプリケーションを使用します。
      1. 【申込方法】VR:代表的な風景を示す.XMLファイルに関連付けられているファイルを開いて、静的モードでモニター上の仮想風景をプレビューします。動的なインタラクションの場合は、ペアの設定を開きます。XLSX ファイルを制御アプリケーションにコピーします。
      2. [application] control: .XSLX ファイルに関連付けられているこのアプリケーションを開いて、システムに関連付けられているアクセサリ デバイスを確認します。ここから、報酬チューブを手動で伸縮させたり、液体報酬を分配したり、リアルタイムのデータ取得を表示したりできます。
      3. [アプリケーション] スケジュール デザイナー: このアプリケーションには、XAML ファイルを調整して、実験内でのイベント トリガーのスケジュールを確立する機能があります。たとえば、カスタマイズ可能なトリガーを設計して、報酬の分配期間を決定し、マウスの試行間の休憩期間を定義します。
3. スタートアップの例:ステップ3.2.1.1-3.2.1.3の調整可能なコンポーネントに基づいて、研究プロトコルがどのように見えるかを決定することから始めます。オペラントプロトコルが明確に定義されたら、以下の手順に従って、VRシステムにプリセットされていたテンプレート実験の1つを開きます。
   1. VR アプリケーションを開くと、Data サブフォルダーが開きます。作成した仮想ランドスケープをXMLファイルとして保存します。このファイルを開くと、VRモニターに仮想風景が表示されます。
   2. Control アプリケーションを開き、画面の右上にある [フォルダを開く] アイコンに移動します。 アイコンをクリックすると、対応する .XLSX実験構成が配置されています。を開きます。VR アプリケーションで開いた .XML ファイルと同じ名前の XLSX ファイル。拡張可能な報酬装置のポンプやモーターなど、定義されたシステムアクセサリが、アプリケーション内の制御タブに表示されるようになりました。
   3. これら 2 つのアプリケーション間の調整により、対話型の仮想ランドスケープを作成できるため、実験的な試用版を開始します。最終的に、この統合により、XY平面内の距離やタイムスタンプ付きの報酬の収集など、重要なデータの監視が容易になります。
4. データ取得:タイムスタンプ付きの位置データと報酬である、最も価値のある行動データをシステムから抽出します。これらのデータは、ログファイルとして個別に保存されます。
   1. 位置データ:これを取得するには、以下の手順に従います。
      1. マウスのタイムスタンプ付きXY位置データを取得するには、まず、目的のデータ取得の迷路のスプレッドシートファイルを開きます。表 1 では、コマンド WriteVRAndCamInfoToFile を列 A の他のセルの下のセルの 1 つに配置します。現在、位置データは、試用後に日付付きのCSVファイル(Log files-MM.DD.YYYY_VRandPathPos.csvという名前)として自動的にconfigsフォルダに保存されます。
      2. 試用後に位置データをエクスポートするには、制御アプリケーションを閉じると、データは日付付きのCSVファイルに保存されます。このファイルには、特定の日の特定のデータがすべて含まれているため、各被験者がボールにいつ配置され、いつボールから外されたかを手動で記録するように注意してください。ファイルを開き、Unicode UTF-8 文字セットを使用してインポートします。列AにはDateTimeというラベルが付けられており、[A] タブ を右クリックして[ セルの書式設定]をクリックします。時間に移動し、 MM/DD/YYYY HH:MM:SS オプション。これで、各システムイベントは、さらなるデータ分析のために時系列でカタログ化されます。
   2. 報酬データ: これを取得するには、以下で説明する手順に従います。
      1. ポンプの作動(報酬分配)に関するデータは、システム内に日付付きのログファイルとして自動的に保存されるため、位置データのようにコマンドを入力する必要はありません。これらにアクセスするには、configs フォルダの Log Files サブフォルダに移動します。
      2. 報酬データの位置データについて手順3.4.1を繰り返して、データをスプレッドシートファイルとしてエクスポートします。configs フォルダを開き、フォルダで表示したときに日付のリワード ファイル (Corridor- MM.DD.YYYY または Corridor_Linear_Run- MM.DD.YYYY) を選択します。これにより、マウスが報酬を獲得した日時が提供され、マウスが採用したパラダイムに応じて、これをさらなるデータ分析に使用できます。

4. 行動課題

注:行動神経科学の確立された方法論に従って、定式化されたタスクは報酬ベースの連想学習技術を採用しています。特定の行動を強化するために即時の報酬を採用することで、動物はVRのテレポーテーション機能によって促進され、反復的なタスクを実行するように効果的に訓練されます。仮想行動フレームワーク内では、テレポーテーション機能により、マウスは物理的な操作に関連するストレスなしにタスクに従事する能力を得ることができ、同時に、類似の現実世界のタスクに必要なセットアップ時間を短縮します。トレーニングセッション中は、実験環境内で薄暗い赤色の頭上照明を使用します。この予防措置は、^{白色光の使用}とは対照的に、マウスにおける赤色光に対する視覚知覚感受性の低下のために推奨され、これにより、仮想現実(VR)画面の知覚に対する潜在的な干渉が軽減される。

1. 慣れ
   1. 体液調節への慣れと同時に球形トレッドミルへの慣れを開始し、正しいタイミングの生理学的動機付けを使用して、リックチューブを報酬に関連付けます。リニアトラックトレーニングを開始する前に、3日間の慣れ期間が推奨されます。
   2. 1^日目 は、計量後5分間マウスを取り扱います。この相互作用の間、マウスがケージ内にある間にヘッドバーインプラントをそっとつかむことが推奨され、そのような操作に慣れ親しむことができます。この日にVRが収められているエリアに案内していただくことで、実験的な試みが行われる空間環境を予測させることができます。この慣れの最初の日は、体重100 mgあたり15 mLの体液調節の開始と一致します。
   3. 体液量調節ステップ100 mgあたり10 mLへの移行と一致する^2日目に 、再びマウスを5分間取り扱います。ケージ内でヘッドバーを優しく握り続けます。マウスが球形トレッドミルに5〜20分間慣れ親しむことができるようにしながら、ヘッドバーをホルダーに取り付けます。無限に繰り返されるトラック上またはソフトウェアプログラムがアクティブにならずに。これにより、頭部固定状態への適応が容易になります。この期間中にマウスが老廃物を排泄する可能性があることが予想されますが、これは通常、連続するセッションで減少します。
   4. 体液調節パラダイムの最終日(体重100 mgあたり5 mL)に対応する^3日目に 、マウスを5分間取り扱います。次に、エアクッション付きの球形トレッドミルにしっかりと取り付け、報酬チューブを通じて液体の報酬に導入します。
      1. ナイーブマウスにリックスパウトを導入すると、最初は混乱するので、マウスがチューブから飲むことになっていることを認識していることを確認してください。
   5. 無理をしないように、以下のマウスのガイドラインの位置付けを適用し、チューブに対するボール上のマウスの位置を個別化して、快適な方法で報酬を届けるようにします。開始するときは、マウスがチューブから水を飲んでいることを確認してください。これは、水制限条件下で自然に飲む液体が提示されたときに、ほとんどのマウスで自然に発生します。
2. マウスの配置
   1. 事前ポジショニング:マウスをボールの上に置く前に、中央の報酬チューブを伸ばし、先端に小さな報酬の滴を置きます。マウスをボールの上に置く前に報酬チューブを伸ばして、マウスが頭を固定した後にチューブを前方に伸ばしすぎたことによる怪我を防ぎます。報酬チューブを球形のトレッドミルから5〜15 mm上に持ち上げて、注ぎ口を舐めるには頭の自然な前向きの姿勢が必要になるようにします。
   2. ヘッド固定:マウスをヘッド固定するには、マウスを球形トレッドミルのハンドラーの利き側に置きます。次に、ハンドラーの利き手を使用して、マウスのヘッドバーをヘッド固定プラットフォームに向かって引きます。ヘッドバーを固定用のスロットに配置し、その後、ハンドラーの利き手ではない手を使用して、ヘッドバーを所定の位置にカチッとはめ込みます。
   3. ボール上の位置:球形トレッドミルへの配置は各マウスごとに個別化しますが、報酬を味わうモチベーションを確保し、全体的なストレスレベルを最小限に抑えるために、次の要件を満たしていることを確認してください。
      1. マウスの中矢状面を球形トレッドミルの中心に並べます。ヘッドバーがまっすぐでない場合は、ヘッドバーではなくマウスの正中矢面が配置の中心と一直線になっていることを確認してください。視覚的に明確さを保つために、 図 3C を参照してください。
      2. マウスの後足が球形トレッドミルの頂点から11cm以内にあり、頭が頂点の後ろにあることを確認します。マウスが静止しているときに、4つの足すべてがトレッドミルに触れていること、および腹部がトレッドミルに触れることができることを確認します。これにより、ランニングのためのボールの適切な歩行と安定性がサポートされます。
      3. マウスが走らないとき、これはボール拒否と呼ばれます。マウスがフリーズし続け、走ろうとしない場合は、過度の不安を感じている可能性が高く、研究者が実験からマウスを除外することを選択します。この研究では、データからの除外を決定するために、5日間のボール拒否の定量的閾値が使用されました。
   4. サイドバイアス:マウスが最初にトレーニングルーチンに慣れ始めたとき、彼らは一方の側を他方よりも好むでしょう。これはタスクのパフォーマンスを妨げる可能性があるため、動物のボールへの取り付け方法の非対称性によるサイドプリファレンスが発生しないように注意してください。ここで採用されているy迷路の課題は、特に動物が報酬の伝達を最適化するために右と左の両方を選択することを要求し、これにより側面の好みを克服することが容易になります。
   5. 報酬の注ぎ口:このアプローチには、キスイット法と呼ばれる穏やかな操作が含まれ、マウスの口が注ぎ口の先端にほぼ触れるまでマウスを延長された舐め管に誘導することで、報酬の正確な配信が保証されます。マウスが報酬を受け取るとき、拡張報酬チューブの持続時間を 1 秒に設定し、マウスが液滴を完全に消費するのに十分な時間を確保します。リックスパウトの位置は、個々のマウスのサイズと優先される位置が異なる場合があるため、マウスごとに個別に調整します。舐めの標準化のために、報酬チューブがすべての試行を通じて中央に留まることを確認します。マウスは、仮想迷路のデザインに関係なく、常に同じ物理的な場所で報酬を受け取ることを期待する必要があります。
      注:この期間の決定は研究者の裁量に委ねられていますが、これらの調査結果は、この時間枠がチューブの収縮前のマウスによる完全な報酬摂取を促進するのに効果的であったことを示しています。 図3B は、配置に適した位置付けの例を示している。
   6. 線形追跡:同様の方法論を採用した以前の研究と一致して、線形追跡タスクを使用して、マウスが直線の廊下を横断するように訓練するのに必要な時間と、マウスによる報酬獲得の予想成功率という2つの主要な調査を調査します。
      1. マウスが流体制限パラダイムと実験用ハードウェアの両方に順応していることを確認します。
      2. 毎日30分のセッションを実行して、1mの長さから始まる線形の仮想廊下に沿って移動します。廊下の終わりに到達し、砂糖滴の報酬を受け取ったら、ネズミを出発点にテレポートして戻します。
      3. より長い迷路(1 m、2 m、3 mなど)への基準に基づく進路を決定します。1分あたり平均2つの報酬を2日間連続で受け取った後、マウスを次の迷路の長さに進めます(図4A)。
      4. 報酬の回収に関するタイムスタンプ付きデータの毎日の記録と、さらに分析するために球形トレッドミルでマウスが移動した距離を文書化します(図4B-D)。
      5. 3 mの線形トラックで1分間に平均2つの報酬を受け取るマウスの場合、線形トラックパラダイムに習熟しているとマークします。マウスは、意思決定を必要とするより複雑な行動課題に進む前に、この段階に到達することをお勧めします。
   7. Complex Behavioral Tasks Requiring Decision-Making (Y-Maze): このフェーズでは、意思決定を必要とする単純な行動タスクからより複雑な行動タスクに進む可能性を探ります。これを実現するには、考案された信号識別Y-迷路タスクを作成します。
      1. このY迷路パラダイム^23,24では、マウスがY字型のように2本のアームがどちらの方向にも45°伸びる選択点に向かって移動することを確認します。迷路の始点から選択点に到達するまで回転を非アクティブ化し、色の異なる2本のアームを発動し、その後、決定ゾーン内でマウスが目的の方向に回転できるようにします。
      2. 報酬ゾーンにつながるアームに入ったら、もう一度ローテーションを無効にします。黒いアームは正しいパスを表し、白いアームは正しくないパスを表します。黒い腕と白い腕を手がかりとして使用して、マウスの視力の潜在的な制限に対応するため、簡単に区別でき、最も単純な形での視覚情報の使用の調査が容易になります。
      3. マウスを訓練して黒い腕に向かって移動し、砂糖の報酬を得ると、各試行はマウスが開始位置に戻ることで終了します。実験計画に、報酬の位置を左右の間でランダムにシャッフルするように組み込み、マウスが報酬を特定の側面ではなく視覚的な手がかりに関連付けるようにします。
      4. Y 迷路を線形コリドーとして設定するのと同じ手順を使用します。Y 迷路パラダイムの進行基準を線形回廊の基準に反映します: 各試行は 30 分間続き、マウスは 2 日間連続して所定の報酬しきい値に到達する必要があります。正しく獲得した報酬の70%のしきい値は、Y迷路での以前のパイロットコホートの平均パフォーマンスに基づいて推奨されます。これはチャンスの閾値(50%)を超えており、マウスがタスクを理解していることを示す合理的に達成可能な割合を表しています(図5A)。
      5. 選択ポイントに到達したら、マウスが正しいアームまたは間違ったアームのいずれかを選択していることを確認します。アームの終わりに、スタート地点にテレポートして戻り、30分以内に迷路を繰り返します。
      6. このアプローチでは、視覚心理物理学に触発されたアプローチが採用されており、迷路を区別するのが次第に難しくなりました。Y迷路パラダイムの進行については、以下の説明に従ってください。
         1. 最初のY迷路では、迷路の選択ポイントに黒と白の単色の腕を提示します。マウスが2日間連続して試行の70%で黒アームを正しく選択した場合は、ますます難易度の高い識別タスクで次のレベルに進みます。これを達成するには、進行の各レベルで、対照的な色の10%を各腕に徐々に導入します。例えば、白人の腕を90%が白人、10%が黒人で構成されるように、またその逆に移行することで、進歩するたびに差別が厳しくなる。
            注:増加の考え方は、50%の白/黒に達することができる場合、アームが区別できなくなるため、効果的な制御になるということです。しかし、マウスが視覚的に識別できた最も遠いのは80%:20%でした(図5B)。

結果

このパイロット研究は、単純な廊下と複雑な意思決定タスク(Y迷路視覚識別タスク)という2つの異なるタスクでマウスを効率的に訓練するための方法論を概説することを目的としています。これらのデータは、VRでの行動訓練の時間的ガイドラインを確立するための基礎となりました。

手続きのステップは、 図1のヘッドバーの外科的埋め込みを概説することから始まります。このインプラントは、行動評価中にマウスの頭蓋骨を安定させるのに役立ち、それによって、特に電気生理学またはイメージング技術と組み合わせて使用される場合に、神経記録の精度を向上させます。

図2と図3は、実験システムのハードウェアコンポーネントとセットアップを示しています。図2は、ペトリ皿噴水方式を利用した送水システムの詳細です。これには、60 mm x 15 mmのペトリ皿を凹面を下にしてケージの床に貼り付け、小さい方の35 mm x 10 mmのペトリ皿を凹面を下にして大きい方の皿の中央に固定し、別の60 mm x 15 mmのペトリ皿を凹面を上にして小さい方の皿の上に置き、貯水池として機能するというものでした。上皿の高さは、マウスが水にアクセスしやすいように、寝具材料による汚染を防ぐために慎重に調整されました。

図 3 は、システム・ハードウェアとマウスの位置のガイドラインを示しています。 図 3A は VR のセットアップを示しており、6 つのスクリーン アレイと中央に球形のトレッドミルが配置されています。 図3B は、トレッドミル上でのマウスの最適な配置を示しており、頭が自然な位置に揃い、4つの足すべてが表面に接触しています。 図3C は、ヘッドバーに対するマウスの正しい配置と正しくないマウスの配置を比較し、マウスの中央面をヘッドバー自体と整列させるのではなく、中央に配置する必要があることを強調しています。

図4 は、報酬獲得曲線を折れ線グラフで示し、VRの1m、2m、3mの狭い通路の予想学習期間を、事前に定義された進行パラメータに基づいて示しています。これは、それぞれのトラック長にわたるマウスの平均速度を示しており、難易度の増加に見合ったタスク学習と改善の証拠として、速度が徐々に増加していることを示しています。また、マウスが線形トラックの基準に到達するのに必要な平均日数を示す棒グラフと、各トラック長の平均速度を示す棒グラフも表示されます。これに続いて、マウスが学習した線形追跡タスクの進行段階も示されています。これらの課題は、学術文献で確立された方法論を再現すると同時に、マウスが達成可能な学習曲線を確保し、レベルを通じてのマウスの進歩を促進するように設計されています。

最後に、 図 5 は Y-Maze タスクに関連するデータを示しています。この図は、黒一本の腕と白一本の腕の単純な区別から始まる、タスクの進歩的な性質を示しています。この初期段階は、マウスが対照的な視覚的手がかりを区別する能力を確立するための基本的なステップとして機能します。タスクの後続のレベルでは、各アームに対照的な色の割合を追加で組み込むことにより、複雑さが増し、マウスの識別能力がさらに困難になります。タスクの難易度が徐々に向上していることは、黒と白の単色の腕から、一方の色が90%、もう一方の色が10%で構成される腕への移行によって例証されています。特に、 図5 に示すデータは、識別精度が進行するたびに向上する一方で、一部のマウスは一貫して視覚識別能力の閾値を示し、最大80%/20%の白人/黒人識別に達することを示しています。この観察結果は、Y-Maze課題の文脈におけるマウスの視覚識別能力に内在する限界を強調しており、課題の実現可能性と被験者の認知能力に関する貴重な洞察を提供している。その後、Y迷路トラックタスクの進行段階は、文献で確立された方法論と一致するように設計されており、詳細に説明されています。これらの段階により、マウスの実行可能な学習曲線が確保され、レベルが徐々に進むのをサポートしました。

図1:ヘッドバー埋め込み術の外科的指示書(A)切開部位はマウスの頭蓋骨に印が付けられています。(B)ネジは、前頭間縫合糸の左1 mm、ブレグマの少し下、前頭間縫合糸の右側3 mm、ラムダの少し上に埋め込む必要があります。(C)ヘッドバーは、前頭間縫合糸に沿って配置する必要があります。(D)ヘッドバーインプラントの上に歯科用セメントを塗布します。(E)歯科用セメントを塗布した後のヘッドバーの実際の視覚化。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:ペトリ皿噴水方式による給水システム。 60 mm x 15 mmのペトリ皿をケージの床に凹面を下にして固定しました。小さい35 mm x 10 mmのシャーレを大きいディッシュの中央に配置し、別の60 mm x 15 mmのシャーレを上にして凹面を上にして置き、貯水池として機能しました。この設定により、水が寝床によって汚染されず、マウスがアクセス可能になりました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:システムハードウェアとマウスの位置のガイドライン (A)使用したVRセットアップが表示されます。6画面のセットアップが使用され、球形のトレッドミルが中央に配置されました。(B)球形トレッドミル上の最適なマウス配置の側面図。マウスの頭は自然な位置にあり、4本の足はすべて球形のトレッドミル上にあります。(C)上面図:ヘッドバーに対するマウスの正しい配置と正しくない配置。正しい配置のためには、マウスの中央矢状面をヘッドバー自体ではなく中央に配置する必要があります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:線形トラックデータ(A)提示されたデータは、各30分間の試用期間中に収集された毎日の報酬を示しています。マウスは、2日間連続で1分あたり平均2つの報酬を達成すると、より長いトラック長に進み、合計60の報酬(しきい値)を達成しました。(B)マウスが課題に習熟するにつれて、その速度は徐々に増加し、報酬強化の有効性を示している。このグラフは、トラック上の各マウスの1日の平均速度をcm/sで示し、学習した行動の直線的な進行を示しています。(C)この棒グラフは、各マウスが個々のトラックの長さで習熟度を獲得するのにかかった時間を示しており、各トラックの長さについてそれぞれの平均と標準誤差が示されています。(D)この棒グラフは、さまざまなトラック長にわたって各マウスによって達成された平均日速の平均誤差と標準誤差を示しています。ほぼ直線的な進行は、学習された走行速度の向上を示唆しています。(E) これは、より長いバージョンの迷路に進む前に、2日間連続して60報酬の試用期間を必要とする線形追跡タスクの進行を示しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:Y-Mazeのデータ。 (A) Y迷路の進行の各ステージで獲得した報酬の分布を示しています。この解析は、線形トラックのすべてのフェーズを完了した4匹のマウスのサブセットにのみ焦点を当て、それによって男性と女性の両方の参加者の公平な表現を確保しました。(B)この視覚的表現は、Y-Maze課題の段階を示しており、マウスは2日間連続で70%の正解を達成すると前進します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

この研究では、VR環境におけるマウスの行動反応を調査するための包括的なアプローチを採用し、外科的処置の実施、体液制限プロトコル、システムセットアップ、および行動課題に焦点を当てました。これらの調査結果は、手順の詳細、トレーニングの時間枠、および成功率を提供することで、この分野に貢献しています。これにより、マウスでのVR手順のより効果的な採用が可能になり、この手順を研究に使用することに関心のある研究室の計画と実装が容易になります。

ヘッドバーの外科的埋め込みは、VR環境での頭部固定行動実験を容易にするために不可欠でした。確立されたプロトコルに注意深く従い、適切な術後ケアを提供することで、動物の健康と行動への悪影響を最小限に抑えながら、ヘッドバーの統合を成功させました。さらに、マウスの水分摂取量を調節し、水分補給と喉の渇きのレベルを維持するために、体液制限プロトコルが実施されました。段階的な順応プロセスと定期的な水へのアクセスは、動物の福祉を確保しながら行動課題の実行を容易にするために重要でした。

VR行動システムのセットアップには、ハードウェアとソフトウェアのコンポーネントを統合して、マウス用の没入型仮想環境を作成することが含まれていました。完全没入型のバーチャルディスプレイ、リキッド報酬システム、球形トレッドミルとしての発泡スチロールボール、ヘッドホルダーの利用により、実験条件とデータ取得を正確に制御することができました。線形トラックやY迷路パラダイムなどの行動課題は、移動、意思決定、報酬処理など、マウスの行動の主要な側面を調査するために慎重に設計されました。

実験手順を最適化するための最善の努力にもかかわらず、研究中にいくつかの課題に直面しました。個々のマウスの応答のばらつきや、ハードウェアとソフトウェアの統合に関連する技術的な問題が、データの収集と解析に課題をもたらしました。さらに、体液制限プロトコルに依存していたため、動物の水分補給状態を注意深く監視し、それに応じて実験手順を調整する必要がありました。時々、ネズミはボールの上に置かれたときに苦労したり、報酬の注ぎ口から水を飲まなかったり、フリーズしてボールの上を走れなくなったりしました。これらの課題の一部は一時的なものである可能性がありますが、マウスを監視して、マウスの進行に支障がないことを確認することが重要です。同業他社と比較して進歩を示さなかったマウスは、研究から撤退すべきである。同様の実験では、パラダイム²⁵を学習できないため、55匹のマウスのうち4匹が除去されました。5日間連続してボール上で一貫して動かないマウスは、体重、飲酒のための報酬スパウトへのアクセス能力、および根本的な問題が存在しないことを確認するためのボール上の位置を徹底的に評価した後、研究から除外されました。このような場合、研究を効率的に再開するためにどのような戦略を取るべきかを決定するのは、研究者の裁量に委ねられています。

これらのトレーニングプロトコルは、マウスが行動タスクを実行する習熟度を確保しながら、マウスに徐々に挑戦するように設計されています。線形トラックからY迷路パラダイムへの進行の基準は、マウスが所定のパフォーマンスしきい値(連続して成功した試行の達成や報酬獲得など)を満たす能力に基づいていました。厳格なトレーニングプロトコルの実施により、マウスの行動能力と、ますます複雑化するタスクへの適応性を評価することができました。これらの慎重に構造化されたプロトコルは、行動神経科学の分野の研究者に強固なフレームワークを提供し、多様な実験パラダイムのために動物を評価し訓練するための体系的なアプローチを提供します。研究者は、進行の明確な基準を概説することで、実験対象の学習曲線を効率的に測定し、それに応じてトレーニングパラダイムをキュレーションすることができます。さらに、この方法論的アプローチは、実験間の再現性と標準化を促進し、比較分析を容易にし、動物モデルにおける認知プロセスと学習メカニズムの理解を促進します。

マウスのVRパラダイムを設計する際には、タスクの複雑さとトレーニングの進行に関して利用可能なアプローチの範囲を認識することが重要です。このプロトコルは、実験デザインを構築するための広範なフレームワークを提供しますが、報酬の配信、バイアス制御、刺激タイプ、タスクの進行、および研究のニーズに応じたシステムパラメータなどの特定の側面を調整するのは研究者次第です。 たとえば、一部の研究では、即時のタスクエンゲージメントに焦点を当てた、より合理化されたアプローチを選択しています。一例は、異なるタスク間で漸進的な学習レジメンを採用するのではなく、単一の一貫したT迷路タスクを実装したKruminらです。対照的に、他の研究では、刺激強化戦略や聴覚手がかりなど、多様な試験デザイン要素を提供しています。この研究では、誤った試行に対する罰として聴覚フィードバックを利用し、正しい試行に対する報酬として水のみを提供しました²⁶。逆に、Zhaoらは、正しい試験に対する報酬として10%ショ糖溶液を使用し、誤った試験に対するいかなる形の罰も組み込んでいない²⁷。それどころか、彼らは、動物の以前の選択から合図の方向を切り替える確率を高めたり、モチベーションを高めるために毎日の水手当を調整したりするアンチバイアストレーニングなどの方法を通じて、誤った反応を軽減することに焦点を当てました。Zhaoらが、Harveyらが観察した選択依存的な活性化シーケンスとは対照的に、軌跡と空間的選好によって説明される後頭頂葉皮質細胞の選択性を発見したことからも明らかなように、課題全体にわたる空間的な手がかりの存在など、実験デザインの違いは、神経コーディングの異なる解釈につながる可能性がある^27,28.使用された特定のハードウェアには、6台のLCDモニター、拡張可能なリックスパウト、およびエアクッション性の発泡スチロールボールトレッドミルが含まれていたことに注意することが重要です。^{プロジェクター29}とコンピュータモニターの使用、非球形トレッドミル³⁰、固定¹⁰と拡張可能なリックスパウトの使用など、ラボ間のバーチャルリアリティシステムには多くの違いがあります。

結論として、この研究は、VR環境におけるマウスの行動反応に関する貴重な洞察を提供し、複雑な行動を調査するために没入型技術を採用する可能性を示しています。今後の研究活動では、実験プロトコルの改良、意思決定プロセスの根底にある神経メカニズムの探索、および調査結果の臨床応用への変換に焦点を当てるかもしれません。マウスの行動の理解が進むことで、科学者は健康と疾患の両方における複雑な行動の根底にある神経回路と認知プロセスをさらに解明することができます。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.4 mm Screws (00-96 X 3/32)	Protech International	8L0X3905202F	For Added Headbar Stability
Bupivocaine	Hospira	NDC:0409-1162-19	Local Anesthetic
Buprenorphine	Wedgewood Pharmaceuticals	SKU: BUPREN-INJ010VC	Analgesia
Buzzers	Wahl	1565q	For Shaving Surgical Region
Drill and microinjection robot	Neurostar	17129-IDA	Stereotaxis
GLUture	Zoetis	32046	Surgical Adhesive
Head-bar Implant	Luigs-Neumann	130060	Mouse Head Implant
Heating Pad (Lectro-Kennel)	K&H Manufacturing	100212933	Post-operative
Hemostats	World Precision Instruments	501291	Surgical Tool
Hydrogen Peroxide	Swam	L0003648FB	Cleaning Agent
Isoflurane	Dechra	B230008	Surgical Inhalation Anesthetic
Isoflurane/O2 Delivery device w Nosecomb attachments	Eagle Eye Anesthesia Inc.	Model 50 Anesthesia	Surgical Device
Metabond	Parkell	CB-S380	Adhesive Cement
Microscissors	Fine Science Tools	15000-08	Surgical Tool
Oxygen	Praxair	UN1072	Surgical Oxygen
Povidone-Iodine Swabstick	Dynarex	g172095-05	Surgical Tool
Saline	Hospira	NDC:0409-1966-02	Hydration Agent
Sterile Cotton Tipped Applicator (Q-tips)	Puritan	25-806 2WC	Surgical Tool
Sucrose	Fisher Chemical	CAS 57-50-1	Primary Reinforcer/Motivator/Reward
Tweezers	World Precision Instruments	504505	Surgical Tool
Virtual Reality System	PhenoSys	JetBall-TFT	The JetBall, an air cushioned spherical treadmill allows an animal to navigate effortlessly in a virtual world projected on 6 surrounding monitors.
White petrolatum lubricant eye ointment ointment	AACE Pharmaceuticals	NDC:71406-124-35	Eyelube