カルシウムイオンチャネルの活性化を研究するためのシングルセルカルシウムイメージング

要約

この記事では、Fura-2/AM色素を用いたシングルセルCa²⁺イメージングを使用して、細胞内のカルシウムイオン(Ca²⁺)濃度をリアルタイムで定量的にモニタリングする方法を紹介します。この技術により、効率的な色素ローディングと、蛍光強度比によるCa²⁺レベルの正確な計算が可能になり、研究アプリケーションのためのシンプルで迅速なアプローチが可能になります。

要約

シングルセルCa²⁺ イメージングは、温度、電圧、天然化合物、化学物質などのさまざまな刺激によって活性化されるCa²⁺ チャネルの研究に不可欠です。これは主に顕微鏡イメージング技術と関連するCa²⁺ インジケーターFura-2/AM(AMはアセトキシメチルエステルの略語)に依存しています。細胞内では、Fura-2/AMはエステラーゼによって加水分解されてFura-2になり、遊離細胞質Ca²⁺と可逆的に結合することができます。結合すると、最大励起波長は380nmから340nm(Ca²⁺で飽和した場合)にシフトします。放出される蛍光強度は、結合したCa²⁺の濃度に定量的に関連しています。340/380比を測定することにより、細胞質中のCa²⁺ 濃度を決定することができ、異なるサンプル間での蛍光プローブのローディング効率の変動によって引き起こされるエラーを排除することができます。この技術により、複数の細胞におけるCa²⁺ の変化をリアルタイム、定量的、かつ同時にモニタリングすることができます。結果は .XLSX」形式により、高速で直感的な変更曲線が生成されるため、検出効率が大幅に向上します。この記事では、さまざまな実験的観点から、内因性または過剰発現チャネルタンパク質を持つ細胞でCa²⁺ シグナルを検出するためのこの技術の使用をリストしています。その間、細胞を活性化するためのさまざまな方法も示され、比較されました。その目的は、シングルセルCa²⁺ イメージングの使用方法と応用について、読者により明確に理解していただくことです。

概要

Ca²⁺ は、細胞シグナル伝達において重要な役割を果たし、筋収縮¹、神経伝導²、分泌³、遺伝子発現⁴などのさまざまな細胞機能を調節し、それによって複数の生理学的プロセスに影響を与えます。Ca²⁺ 濃度が異常になると、不整脈⁵、凝固障害⁶、ホルモンバランスの乱れ⁷などの疾患を引き起こす可能性があります。したがって、細胞内Ca²⁺ 濃度変化のメカニズムを研究することは最も重要です。

細胞内のCa²⁺濃度の調節には、高Ca2⁺選択的カルシウム放出活性化カルシウム(CRAC)チャネル⁸やTRP^{ファミリー9}の非選択的カチオンチャネルなど、さまざまなイオンチャネルが関与しています。これらのイオンチャネルは、伝統的な^漢方薬

プロトコル

実験方法は、清華大学と北京中医薬大学のIACUCガイドラインによって承認され、それに従っています。このプロトコルは、いくつかの新生児マウス(生後3日以内、性別無作為化同腹仔、C57BL/6マウス)の皮膚から単離された初代ケラチノサイトを含む、さまざまな細胞タイプにシングルセルCa²⁺ イメージング法を導入します。本試験で使用した試薬および装置の詳細は、 資料表に記載されています。

1. 細胞調製

手記： 初代細胞、内在性標的遺伝子を持つ細胞株、または過剰発現プラスミドをトランスフェクトした細胞株はすべて、シングルセルCa²⁺ イメージングに適しています。この研究で使用されたプラスミドは、清華大学のXiao Bailong教授の研究室から入手しました。これらのプラスミドは、GFP蛍光タンパク質とヒトSTIM1、DsRed蛍光タンパク質とヒトOrai1、mRuby蛍光タンパク質とウサギTRPV1、および赤色蛍光タンパク質mCherryの配列をファージプラスミド^{ベクター10}に組み込むことによって構築した。

1. 直径8mmの滅菌スライドガラスを24ウェ....

結果

温度応答検出
初代ケラチノサイト
初代ケラチノサイトを新生仔マウスから単離し、確立されたプロトコル¹⁰に従って調製した。これらの細胞は、スライドガラスを含む24ウェルプレートに播種されました。Fura-2プローブを装填した後、 図2Aに示すように、顕微鏡下で380nmの波長で焦点を調整し、細胞形?.......

ディスカッション

シングルセルCa²⁺イメージングシステムの用途は広範であり、ケラチノサイト、幹細胞¹⁶、肝細胞、心臓細胞¹⁷、足細胞¹⁸、免疫細胞、標的タンパク質を過剰発現する細胞株^10,19など、さまざまな細胞タイプにおけるCa²⁺シグナルの研究が可能です。この技?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Camera	Nikon
Capsaicine	Sigma	211275
CL-100 temperature controller	Warner Instruments
Cyclopiazonic Acid (CPA)	Sigma	C1530
DG-4 light	Sutter Instrument Company
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Amresco	231
DPBS	Thermofisher	14190144
Fluorescence imaging software (MetaFluor, Paid software)	Molecular Devices
Fluorescence microscope	Nikon
Fura-2/AM	Invitrogen	F1201
HBSS buffer	Gibco	14175103
HEPES	Sigma	H3375
Lipofectamine 3000	Invitrogen	L3000008
Pluronic F-127	Beyotime	ST501
poly-D-lysine	Beyotime	ST508
SC-20 liquid circulation heating/cooling device	Harvard Apparatus
White-light source	Nikon