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要約

ここで使用した実験は、分子ドッキングとプローブ技術を組み合わせて、伝統的な漢方薬の低分子とタンパク質標的との間の相互作用を予測および検証する方法を示しています。

要約

脱ユビキチン化酵素(DUB)は、ユビキチン化の恒常性を調節する上で極めて重要な役割を果たしており、UCHL3は無数の生理学的および病理学的プロセスに複雑に関与する典型的なシステインDUBです。したがって、ユビキチンC末端加水分解酵素L3(UCHL3)を標的とする低分子阻害剤の開発は非常に重要です。このプロトコルは、UCHL3 に代表されるシステイン DUB の低分子阻害剤の仮想スクリーニングと in vitro 検証のプロセスを確立することを目的としています。まず、UCHL3の潜在的な阻害剤を分子ドッキング技術を使用して仮想的にスクリーニングし、薬物とタンパク質標的との間の相互作用を視覚化します。その後、スクリーニングされた薬剤であるDanshensuの有効性が、 in vitro 活性阻害アッセイを通じて検証されます。ユビキチン-7-アミノ-4-メチルクマリン(Ub-AMC)およびヘマグルチニン-ユビキチン-ビニルスルホン(HA-Ub-VS)は、UCHL3の活性を評価するために低分子阻害剤とDUBに競合的に結合できるため、 in vitro 活性試験のプローブとして使用されます。その結果、Danshensuは分子ドッキングにおいてUCHL3と良好な結合親和性を有し、HA-Ub-VSとUCHL3の活性を競合的に阻害できることが示されました。これらの知見は、UCHL3を標的とする治療薬のさらなる研究開発のための重要な参考資料となります。

概要

ユビキチン化は、タンパク質の翻訳後修飾であり、E1ユビキチン活性化酵素、E2ユビキチン結合酵素、およびE3ユビキチンリガーゼが標的タンパク質にユビキチンを結合するプロセスであり、ユビキチン化の全過程は、脱ユビキチン化酵素(DUB)1,2,3,4によって逆転することができる。DUBは、その重要な生理学的および病理学的役割から、創薬の重要な標的と考えられています5,6。

ヒトでは100を超えるDUBが同定されています7,8。それらは通常、ユビキチンのC末端と基質または別のユビキチン分子のリジン残基との間のイソペプチド結合を切断する役割を担うイソペプチダーゼとして機能します9,10。現在、ユビキチン特異的ペプチダーゼ(USP)、卵巣腫瘍プロテアーゼ(OTU)、Jab1/Mov34/Mpr1 Pad 1 N末端+ドメインプロテアーゼ(JAMM)、ユビキチン含有新規DUBファミリープロテアーゼ(MINDY)、ユビキチンC末端ヒドロキシラーゼ(UCH)、マチャド・ジョセフィンドメインプロテアーゼ(MJD)、ジンクフィンガー含有ユビキチンペプチダーゼ1(ZUP1)の7つの主要なファミリーに分類されています9。.亜鉛メタロプロテアーゼファミリー11に属するJAMMに加えて、他のDUBは、触媒システイン、ヒスチジン、および第3の酸性残基からなる触媒トライアドを特徴とするシステインプロテアーゼである12,13。この特異性により、酵素の活性部位または近くのアロステリックポケットを標的とする低分子阻害剤の開発への道が開かれます。

脱ユビキチン化酵素研究の分野では、その活性を特徴付けることに大きな課題が存在します14,15。活性プローブに基づく特性評価は、DUB阻害剤を研究するための重要なアプローチとして機能します16。細胞溶解物または組換えタンパク質中の活性ベースのプローブおよび阻害剤を用いて競合アッセイを実施することにより、DUBの活性を特徴付け、これらの酵素を標的とする低分子阻害剤の開発を促進することができます。Ub-AMCは、ユビキチン17,18のC末端に結合した蛍光基を持つDUB活性を検出するために使用された初期のプローブである。DUBが触媒活性を発揮すると、AMCが大量に放出され、検出した光の蛍光強度が亢進します。このプローブは、DUB阻害剤19,20のハイスループットスクリーニングに広く使用されています。HA-Ub-VSプローブは、DUB活性の測定にも使用されます21。ユビキチンのC末端にビニルスルホン基があり、DUBの自殺基質となっています。ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)分離後、ウェスタンブロッティング22,23,24を用いて活性DUBを検出することができる。

伝統的な中国医学(TCM)は、2000年以上にわたって薬用植物を使用してきました。天然物から新薬を開発することは、有効成分の特定とそのメカニズムの解明に重点を置くことで、医学的に大きな意義を持つ25。 サルビアミルティオルリザ Bgeは、がん、心血管、肝臓、神経など、さまざまな疾患の治療に広く使用されているハーブです26。現在、タンシノン27、ダンシェンス28、タンシヌ酸29などの既知の低分子が含まれています。これらの化合物は、抗血栓作用、抗酸化作用、抗腫瘍作用など多様な生物活性を示すため、研究に高い価値がある26。最近の研究では、DanshensuがSARS-CoV-2の3-キモトリプシン様プロテアーゼ(3CLpro)の共有結合阻害剤であることが特定されています30。3CLproの活性部位残基C145と共有結合を形成することが示されており、 Salvia miltiorrhiza Bgeに潜在的な低分子プロテアーゼ阻害剤が存在することを示しています。

ユビキチンC末端加水分解酵素L3(UCHL3)は、DUBのUCHファミリー内のシステインプロテアーゼに属します。それは、その機能を効果的に触媒するために、システイン95、ヒスチジン169、アスパラギン酸184のような保存された残基に依存している31,32。それは、細胞周期、相同組換え、およびタンパク質結合DNA切断の修復を含む複数の分子経路において重要な役割を果たす33。さらに、それは、卵巣癌、前立腺癌、膵癌、結腸直腸癌、および非小細胞肺癌34のような様々な癌においてアップレギュレーションされる。これらの研究に基づくと、UCHL3は疾患治療の有望な標的であると思われます。UCHL3のいくつかの低分子阻害剤が同定され、臨床使用に向けて進んでいます35,36。

本研究では、 Salvia miltiorrhiza BgeとUCHL3由来の低分子との間の相互作用を調べるために、分子ドッキングを行いました。その後、DUB特異的プローブUb-AMCおよびHA-Ub-VSを用いた in vitro 実験により、DanshensuがUCHL3の低分子阻害剤として同定されました。また、分子ドッキングはDanshensuの潜在的な結合部位を予測し、その作用機序を示唆しています。

プロトコル

1. Salvia miltiorrhiza BgeとUCHL3の低分子構造のダウンロード

  1. 低分子ファイルをダウンロードします。
    1. TCMSPデータベース(https://old.tcmsp-e.com)を開き、danshen(ハーブ名)を入力してから、検索を押して、結果リストのRadix Salviaeをクリックします。
    2. 1つずつ ダウンロード をクリックし、2D構造を.mol2形式で 保存 します。
  2. タンパク質ファイルをダウンロードします。
    1. PDB データベース (https://www.rcsb.org/) を開き、UCHL3 と入力して、検索を押します。「Homo sapiens」をクリックし、「絞り込みで検索」を押します。
    2. small molecule-protein co-crystallizing structure 1XD3 を選択し、 download filesをクリックして PDB 形式を選択します。

2.分子ドッキング

  1. ファイルを保存します。
    1. デスクトップに danshen_UCHL3 docking という名前の新しいフォルダを作成し、 Salvia miltiorrhiza Bge および UCHL3 構造体の化合物をこのフォルダに保存します。フォルダに英語で名前を付けます。そうしないと、ファイルのインポートに失敗します。
  2. パスを設定します。
    1. Maestroソフトウェアを開き、[ ファイル]をクリックし、[ 作業ディレクトリの変更]を選択し、[ デスクトップ]をクリックし、 danshen_CUHL3ドッキングフォルダをダブルクリックして選択し、[ オプションの選択]をクリックします。
  3. 低分子プロセッシング
    1. 低分子構造をインポートします。
      1. 「ファイル」および「構造のインポート」オプションをクリックします。[デスクトップ]をクリックし、ドッキングフォルダをダブルクリックして、[Salvia miltiorrhiza Bge]構造ファイルをクリックします。次に、[開く] をクリックして、すべての小分子をインポートします。
    2. 小分子を準備します。
      1. 「タスク」をクリックし、「LigPrep」オプションを選択します。表示されたLigPrepウィンドウで、Use structure fromオプションのプロジェクトテーブルをクリックし、computationの下のDetermine chiralities from 3D structureオプションにチェックを入れ、他のすべてのソフトウェア設定をデフォルトのままにします。
      2. ジョブ名を danshen_ligprep1 に変更し、[ 実行 ] をクリックして低分子処理を実行します。
  4. タンパク質構造プロセッシング
    1. タンパク質構造をインポートします。
      1. 「File」オプションと「Import Structures」オプション、「Desktop」をクリックして、danshen_CUHL3ドッキングフォルダをダブルクリックします。
      2. UCHL3 タンパク質構造ファイルをクリックし、[開く] をクリックしてタンパク質構造ファイルをインポートします。
    2. タンパク質を準備します。
      1. UCHL3 と低分子をつなぐ 2 つの共有結合を選択し、[ 削除 ] ボタンを使用して削除します。次に、欠失後に不完全な2つのタンパク質残基を選択します。 [Build ] ボタンをクリックし、[ Other edits] を選択し、Gly75 の場合は [C ] ボタンをクリックし、Cys95 の場合は [Mutate Residue ] と [CYS] を選択します。
      2. 「タスク」をクリックし、「タンパク質調製ワークフロー」オプションを選択します。他のすべてのソフトウェア設定はデフォルトのままにします。ジョブ名を UCHL3_protein pre に変更し、「実行」をクリックしてタンパク質処理を実行します。
    3. ドッキングボックスをセットアップします。
      1. 「タスク」をクリックし、「受容体グリッド生成」を選択し、「ピック」を選択してリガンド分子を特定します。workspac eで小分子を選択すると、小分子の座標を中心としたピンク色のドッキングボックスが表示されます。
      2. デフォルト設定をそのまま使用し、ジョブに 1XD3_danshen_glide_grid という名前を付けて、[ 実行] をクリックします。
        注:1XD3では、小分子はタンパク質と共有結合を形成します。この共有結合を除去して、低分子をタンパク質から分離する必要があります。そうしないと、受容体グリッドのセットアッププロセス中に、低分子を選択できません。
  5. 分子ドッキングを実行します。
    1. 「タスク」をクリックし、「リガンドドッキング」オプションを選択します。受容体グリッドを選択し、[ファイルから] をクリックして、[参照] をクリックします。1XD3_danshen_glide_grid.zipファイルを選択し、[開く] をクリックします。
    2. Use Ligands from as filesをクリックし、Browseをクリックします。「danshen_ligprep1ファイル」をクリックし、「danshen_ligprep1-out. maegz ファイル」を選択して、「開く」をクリックします。
    3. 「設定」をクリックし、「SP」オプションとして「精度」を選択し、ジョブ名を「danshen_UCHL3_ glidedock _SP」に変更して、「実行」をクリックします。
  6. ドッキング結果を表示します。
    1. 「ファイル」および「構造のインポート」オプションをクリックします。[デスクトップ]をクリックし、danshen_CUHL3ドッキングフォルダをダブルクリックします。
    2. danshen_UCHL3_ glidedock _SP ファイルをダブルクリックし、danshen_UCHL3_ glidedock _SP_pv.maegz ファイルをクリックして、[開く] をクリックします。
    3. 「テーブル」オプションをクリックし、「ドッキングスコア」の下にスコアを表示します。
  7. danshensuとUCHL3の相互作用を可視化します。
    1. danshen_UCHL3_glidedock _SP_pv.maegzファイルをダブルクリックして、Maestroで開きます。エントリーリストで、Shiftキーを押しながらdanshensuとタンパク質を同時に選択します。
    2. 右クリックして 「マージ」 を選択し、 新しいストラクチャーを作成します。 新しい構造を選択し、右クリックして [エクスポート] を選択し、[ 構造] をクリックして、ファイルに danshensu_UCHL3 という名前を付けて、 .pdb 形式でエクスポートします。
    3. パネルで 結合構造 を選択し、[ タスク]をクリックして[ 2Dスケッチャー]を選択し、danshensuとUCHL3の間の相互作用の2D構造画像を取得します。
    4. danshensu_UCHL3.pdbファイルをpymolソフトウェアにインポートし、Maestroから取得した2D構造に基づいて視覚化します。

3. タンパク質UCHL3の精製

  1. pHUE-UCHL3原核生物発現プラスミドの構築
    1. NCBI(isform2)から組換えタンパク質UCHL3遺伝子のコード配列を取得します。得られた遺伝子断片を相同組換えによりpHUE-10HISベクターに組み込み、DH5αコンピテントセルに形質転換します。プラスミドDNAを抽出して、目的のコンストラクトを得ます。
  2. 組換えタンパク質の誘導と精製
    1. 細菌培養:
      1. 組換えプラスミドをBL21(DE3)コンピテントセルに形質転換し、アンピシリンを含むLuria-Bertani(LB)寒天プレート上に広げます。プレートを37°Cで一晩インキュベートします。
      2. 単一のコロニーを選び、50 μg/mL アンピシリンを添加した 12 mL の液体 LB 培地に接種し、37 °C で一晩培養します。
    2. トランスフォーメーションとインダクション
      1. 新鮮な培地を使用して、一晩の細菌培養物を2%に希釈します。OD600が0.4-0.6に達したら、イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)を最終濃度0.4 mMまで添加し、16°Cで12時間低温誘導します。
    3. 細菌培養物のコレクション
      1. 細菌培養物を滅菌遠心チューブに移し、2200 x g で10分間遠心分離します。上清を取り除き、菌株を-80°Cで保存して保存します。
    4. 超音波
      1. 緩衝液1(50 mM HEPES pH 7.5、200 mM NaCl、1 mM EDTA)の25 mL(採取した細菌培養物の1/20)に菌株を再懸濁します。次の条件下で細菌の超音波処理を行います:4秒間オン、6秒間オフ、エネルギーを60%に15分間設定します。1%Triton X-100を添加し、4°Cで30〜60分間溶解します。
    5. 上清とペレットの分離
      1. サンプルを9000 x g 、4°Cで30分間遠心分離します。上清を採取し、0.45 μmのメンブレンフィルターでろ過します。50 μL の上清を入力として予約します。
      2. ペレットをバッファー1に再懸濁し、適切な量の5倍サンプルバッファー(25% 1M Tris-HCl [pH 6.8]、10%ドデシル硫酸ナトリウム、0.5%ブロモフェノールブルー、41.67%グリセロール、10% DL-ジチオスレイトール)を加え、100°Cで10分間煮沸します。
  3. タンパク質精製
    1. カラム平衡化
      1. 1 mLのNiNTAニッケルレジンをカラムにロードし、10分間沈降させてから、10 mM、500 mM、および10 mMのイミダゾールを含む5カラム容量のバッファー2(50 mM HEPES pH 7.5、50 mM NaCl)でカラムを順次平衡化します。
      2. ピペットを使用して、10 mM イミダゾール溶液 5 mL(約 5 カラム容量)をカラム壁に沿って加えます。このプロセスは、流量を制御せずに行います。
      3. 液体が充塡剤を覆い、ほぼ排出されたら、500 mM イミダゾール溶液と 10 mM イミダゾール溶液の 5 カラム容量を順次追加して平衡化します。残りの10 mMイミダゾール溶液が充填剤を覆うだけで、フローコントローラーを閉じて平衡化を停止します。
    2. タンパク質精製
      1. ろ過したタンパク質上清を0.5 mL/分(1滴あたり< s)の流速でカラムに通し、フロースルー画分を収集します。Buffer 2 と 0.5 M NaCl を使用して、10 mM、30 mM、50 mM、および 100 mM のイミダゾールの濃度勾配を調製します。
      2. 低濃度から高濃度のイミダゾールまで順次溶出し、ピペットを使用して、流速を制御せずにカラムの壁に沿って約5カラム容量の溶液を添加します。溶出液を清潔な1.5 mL微量遠心チューブに集め、チューブ1本あたり1 mLのフロースルーを採取します。
      3. 5本のチューブを回収した後、各チューブから1 μLのフロースルーを取り出して、1 μLのBradfordバッファーと反応させます。反応が青色のままの場合は、手順を続けます。透明になったら、その濃度で溶出を止めて、次の濃度に切り替えてください。
      4. 100 mM イミダゾールで溶出した後、流量を制御したり溶出液を回収したりせずに、0.5 M NaCl の 10 カラム容量で洗浄してください。
      5. 最後に、500 mM イミダゾール(< 15 s/滴)で溶出します。ピペットを使用して、溶液 1 mL をカラムに加え、前述のゆっくりとした溶出速度を維持します。1.5 mLの微量遠心チューブを使用して溶出液1 mLを回収し、このプロセスを10回繰り返します。
    3. Coomassie Brilliant Blue染色を使用して精製タンパク質を評価します。
      1. 各グループから10 μLを採取し、適切な5xサンプルバッファーを添加した後、100°Cで5分間加熱することにより、以前に得られたペレット、精製前上清、および回収した10本のタンパク質チューブを定量します。
      2. ウシ血清アルブミン(BSA)標準溶液を1 mg/mL、500 μg/mL、および100 μg/mLで調製します。次に、適切な5倍サンプルバッファーを添加し、100°Cで5分間加熱します。
      3. サンプル上でSDS-PAGEゲル電気泳動を行い、ゲルを取り出して、低速シェーカー上のCoomassie Brilliant Blue溶液で室温(RT)で一晩インキュベートします。
      4. 翌日、ゲルを脱色液(エタノール40%、酢酸10%、H2O50%)に移し、必要に応じて穏やかな熱を加えます。ゲルが透明になったら、現像装置で観察し、BSAレベルに基づいて精製されたタンパク質を定量し、シングルバンドをチェックして純度を評価します。
    4. タンパク質の貯蔵:タンパク質をチューブあたり50 μLで微量遠心チューブに分注し、液体窒素で急速凍結し、-80°Cで保存します。

4. UCHL3活性アッセイ(Ub-AMCアッセイ)

  1. タンパク質の調製
    1. タンパク質を氷上で解凍し、サンプルを1000 x g で室温で3分間遠心分離し、BCA法を使用してタンパク質濃度を測定します。バッファー1を使用してタンパク質を40 nMの濃度に希釈します。
  2. グループの設定
    1. Buffer 1をコントロールグループとして、UCHL3を実験グループとして指定します。96ウェルプレートにウェルあたり200 μLのサンプルを加え、グループごとに3回の繰り返しを設定します。
  3. 検出
    1. 測定の直前に、各ウェルにUb-AMCを素早く加え、2〜5秒間激しく振とうします。使用されるUb-AMCの濃度は250 nMです。37°Cの条件下で380nmの励起波長と460nmの発光波長でOD値を測定し、30秒ごとに最大10分間読み取ります。

5. HA-Ub-VSによるUCHL3活性の阻害アッセイ(HA-Ub-VSアッセイ)

  1. タンパク質の調製
    1. タンパク質を氷上で解凍し、サンプルを1000 x g で室温で3分間遠心分離し、BCA法を使用してタンパク質濃度を測定します。タンパク質を10μg/mLの濃度に希釈します。
  2. 低分子の調製
    1. Danshensuを秤量し、高純度水を用いてグラジエントで5mM、1mM、100μM、10μM、1μMに希釈します。
  3. グループの設定
    1. 純粋タンパク質群と低分子医薬品を含まない群をネガティブコントロールグループとして設定します。PR619(DUB阻害剤)をポジティブコントロールグループとして使用し、他のグループを低分子薬物治療グループとして使用します。
  4. サンプル調製
    1. グループ分けに従って、対応する濃度のUCHL3 9 μL と Dansensu 1 μL を各薬物治療群に順次追加します。1 μL の PR619 (使用時 50 μM) をポジティブコントロールグループに加えます。高純度の水とバッファー1を使用して、ネガティブコントロールグループを補います。
    2. ボルテックスで十分に混合し、37°Cで30分間インキュベートします。反応サンプルを氷上に置いて、HA-Ub-VSを最終濃度1 μMまで加え、ボルテックスで十分に混合し、37°Cで30分間インキュベートします。
    3. 適量の5倍サンプルバッファーを加え、100°Cの金属浴で10分間加熱します。サンプルを室温に5分間置き、ゲルにロードします。

6. ウェスタンブロット

  1. SDS-PAGEゲルの調製
    1. ガラスパネルのセットを超純水ですすいでください。プレートをclに置きますamp次に、透明なボードの上に置きます。超純水を加え、10分間リークチェックします。
    2. 接着剤の分配テーブルに従って分離接着剤を準備します。
    3. ゲルカセットから高純度の水を注ぎ、残った水分を濾紙で吸収します。調製した12%分離ゲルを迅速かつ均一に加えます。その後、イソプロパノール1mLを加え、ゲルが固まるまで約30分待ちます。
    4. 接着剤の分配テーブルに従って、濃縮接着剤の最上層を準備します。
    5. 分離ゲルの上部からイソプロパノールを取り出し、高純度の水で3回洗浄し、濾紙で吸い取り乾燥します。調製した3%スタッキングゲルを素早く加え、1.0 mmの15穴コームを挿入し、約30分間待ちます。
      注意: コームを接着剤の表面に対して垂直に保ち、気泡が発生しないようにします。
  2. 電気泳動
    1. コームを垂直に取り外し、十分な量のランニングバッファーを電気泳動装置の内部チャンバーに注ぎ、液体がサンプルウェルを覆うようにします。
    2. タンパク質マーカーと調製した実験サンプルをRTに置き、十分にボルテックスし、短時間遠心分離します。3 μL のタンパク質マーカーを最初の左側のサンプルウェルに加え、続いて 10 μL の実験サンプルを後続の各ウェルに加えます。
    3. 電気泳動槽の外槽に適量のランニングバッファーを投入し、槽を蓋で覆い、電源を接続します。電源が正しく接続されていることを確認します。
    4. 電源をオンにし、サンプルがラインに集中するまで電圧を80Vに設定し、分離ゲルで分離が始まったら電圧を120Vに上げます。
      注意: プロセス中は、底に気泡が形成されていないことを確認してください。気泡が出た場合は、電気泳動装置を片側に傾けて気泡を排出します。
  3. メンブレンへの転写
    1. プラスチックナイフを使用して、ジェルカセットをこじ開けます。サンプルのロードが開始された左上の角を切り取り、向きをマークします。ゲルと必要な濾紙を転写バッファーに1〜2分間浸します。
    2. ポリフッ化ビニリデン(PVDF)メンブレンを、標的タンパク質に必要なサイズに合わせて測定し、切断します。PVDFメンブレンは、メタノールに20秒から1分間浸漬して活性化し、次いで、転写バッファーにゲルと共に浸漬します。
    3. 少量の移送バッファーを移送装置に注ぎ、ローラーを使用してセミドライ転写ユニットを濡らします。コンポーネントを下から上に、濾紙、ゲル、PVDF膜を3層、さらに濾紙を3層の順に配置します。
    4. 各レイヤーを配置した後、ローラーを使用して気泡を取り除きます。蓋をトランスファーバッファーで濡らしてから、装置を覆います。
      注意: 十分な量の転送バッファが存在することを確認し、各レイヤーの完了後に少量を追加します。事前にマーキングを準備し、サンプルがロードされたゲルの左側と右側を区別し、メンブレンの前面と背面を識別します。各層を配置した後、ゆっくりと転がして気泡を取り除きます。
    5. 電源をオンにし、正しい極性を確認します。電流を190mAに調整し、時間を45分に設定します。
  4. ブロッキング
    1. ブロッキングバッファーとして、TBST(1% Tween20)に5%脱脂粉乳溶液を調製します。PVDFメンブレンを前面を上にしてハイブリダイゼーションボックスに入れ、ブロッキングバッファー10mLを注ぎ、RTの低速シェーカーで1時間静かに振とうしてブロッキングします。
  5. 一次抗体のインキュベーション
    1. 抗体溶液1を含む一次抗体を1:1000で調製し、新しいインキュベーションボックスに10 mLの一次抗体を加えます。インキュベーションボックスを4°Cの冷蔵室に置き、シェーカーで一晩保管します。
  6. 二次抗体のインキュベーション
    1. 翌日、インキュベーションボックスに一次抗体を採取し、適切なTBST溶液を加えてシェーカーに載せ、5分間洗浄し、3回繰り返します。
    2. 二次抗体を5%乳溶液で1:5000に調製します。1 mLの二次抗体を湿らせたハイブリダイゼーションボックスの底に滴下します。PVDFメンブレンをタンパク質側を下にして二次抗体に置き、RTで低速シェーカーで1.5時間インキュベートします。
    3. 適切なTBST溶液を追加し、シェーカーに置いて5分間洗います。3回繰り返します。
  7. ストリップの露出
    1. 化学発光試薬AとBを等量取り、振盪し、よく混ぜます。溶液を光から保護します。
    2. 現像液をPVDFメンブレンに均一に塗布し、穏やかに振とうして、メンブレンが溶液で均一にコーティングされるようにします。
    3. メンブレンをゲルイメージングシステムに配置し、露光時間、露光回数、およびその他の関連パラメータを設定します。
      注:開発者はストリップを完全に覆う必要があり、開発は暗い環境で行う必要があります。

結果

Salvia miltiorrhiza BgeにおいてUCHL3を効果的に阻害する小分子をスクリーニングするために、TCMSPのウェブサイトから得られた低分子とUCHL3との間の分子ドッキングを行った。ドッキング結果の上位30の低分子とそのスコアを表1に示します。すべての低分子のドッキング結果を補足表1に示します。研究の代表的な低分子としてDanshensuを選択?...

ディスカッション

DUBは、基質またはポリユビキチン鎖からユビキチンを除去することにより、ユビキチン系全体の恒常性を調節する上で重要な役割を果たす37。近年、これらの酵素は創薬のターゲットとしても注目されています13。しかし、低分子医薬品の開発過程には課題があります。例えば、数万の低分子ライブラリーが関与するハイスループ?...

開示事項

著者は、利益相反を宣言しません。

謝辞

この研究は、北京国立自然科学基金会[助成金番号7244498]の支援を受けました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
30% AcrylamideBeijing Lablead Biotech Co., LtdA3291
Ammonium persulfateChina National Medicines Corporation Ltd10002616
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody #7074Cell Signaling Technology7074P2
BeyoECL PlusBeyotimeP0018S
Bradford Protein Assay KitBeyotimeP0006
ClonExpress Ultra One Step Cloning KitVazymeC115-01
DanshensuShanghai yuanye Bio-Technology Co., LtdB20254
DMSOAmeresco, Inc.21K2356571
Electrophoresis SystemLiuyi Biotechnology112-0630
HEPESSigmaH3375
His-tagged protein purification kit (NTA-Ni agarose magnetic beads)BeyotimeP2247S
Immun-Blot PVDF Membrane, Roll, 26 cm x 3.3 mBio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd1620177
Isopropyl alcoholMacklinI811925
M5 Prestained Protein LadderMei5 Biotechnology Co.LtdMF-212-01
MaestroSchrödinger’shttps://www.schrodinger.com/platform/products/maestro/
Methyl alcoholChina National Medicines Corporation Ltd10014108
MF-MilliporeMilliporeHAWP04700
MyFug mini centrifugeSigmaZ764183
Pierce Dilution-Free Rapid Gold BCA Protein AssayThermo ScientificA55860
PR-619Cell Signaling Technology26065S
Primary Antibody Dilution Buffer for Western BlotMacklinP917820
Recombinant Human HA-Ubiquitin Vinyl Sulfone Protein, CFR&D SystemsU-212-025
Recombinant Human Ubiquitin AMC Protein, CFR&D SystemsU-550-050
Skim MilkBecton,Dickinson and Company232100
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)Ameresco, Inc.205-788-1
TEMEDAmeresco, Inc.2545C134
Tween 20Beijing Lablead Biotech Co., Ltd0777-1
UCHL3 (D25E6) Rabbit mAbCell Signaling Technology8141T

参考文献

  1. Ciechanover, A. The ubiquitin proteolytic system and pathogenesis of human diseases: A novel platform for mechanism-based drug targeting. Biochem Soc Trans. 31 (2), 474-481 (2003).
  2. Schulman, B. A., Harper, J. W. Ubiquitin-like protein activation by e1 enzymes: The apex for downstream signalling pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (5), 319-331 (2009).
  3. Ye, Y., Rape, M. Building ubiquitin chains: E2 enzymes at work. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (11), 755-764 (2009).
  4. Buetow, L., Huang, D. T. Structural insights into the catalysis and regulation of E3 ubiquitin ligases. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (10), 626-642 (2016).
  5. Komander, D., Clague, M. J., Urbé, S. Breaking the chains: Structure and function of the deubiquitinases. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (8), 550-563 (2009).
  6. Clague, M. J., et al. Deubiquitylases from genes to organism. Physiol Rev. 93 (3), 1289-1315 (2013).
  7. Clague, M. J., Urbé, S., Komander, D. Breaking the chains: Deubiquitylating enzyme specificity begets function. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (6), 338-352 (2019).
  8. Harrigan, J. A., Jacq, X., Martin, N. M., Jackson, S. P. Deubiquitylating enzymes and drug discovery: Emerging opportunities. Nat Rev Drug Discov. 17 (1), 57-78 (2018).
  9. Mevissen, T. E. T., Komander, D. Mechanisms of deubiquitinase specificity and regulation. Annu Rev Biochem. 86, 159-192 (2017).
  10. Hershko, A., Ciechanover, A., Heller, H., Haas, A. L., Rose, I. A. Proposed role of ATP in protein breakdown: Conjugation of protein with multiple chains of the polypeptide of ATP-dependent proteolysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (4), 1783-1786 (1980).
  11. Abdul Rehman, S. A., et al. Mindy-1 is a member of an evolutionarily conserved and structurally distinct new family of deubiquitinating enzymes. Mol Cell. 63 (1), 146-155 (2016).
  12. Storer, A. C., Ménard, R. Catalytic mechanism in papain family of cysteine peptidases. Methods Enzymol. 244, 486-500 (1994).
  13. Lange, S. M., Armstrong, L. A., Kulathu, Y. Deubiquitinases: From mechanisms to their inhibition by small molecules. Mol Cell. 82 (1), 15-29 (2022).
  14. Ndubaku, C., Tsui, V. Inhibiting the deubiquitinating enzymes (dubs). J Med Chem. 58 (4), 1581-1595 (2015).
  15. Schauer, N. J., Magin, R. S., Liu, X., Doherty, L. M., Buhrlage, S. J. Advances in discovering deubiquitinating enzyme (dub) inhibitors. J Med Chem. 63 (6), 2731-2750 (2020).
  16. Magin, R. S., et al. Small molecules as tools for functional assessment of deubiquitinating enzyme function. Cell Chem Biol. 28 (7), 1090-1100 (2021).
  17. Dang, L. C., Melandri, F. D., Stein, R. L. Kinetic and mechanistic studies on the hydrolysis of ubiquitin c-terminal 7-amido-4-methylcoumarin by deubiquitinating enzymes. Biochemistry. 37 (7), 1868-1879 (1998).
  18. Li, Y. T., et al. New semi-synthesis of ubiquitin c-terminal conjugate with 7-amino-4-methylcoumarin. J Pept Sci. 20 (2), 102-107 (2014).
  19. Feng, X., et al. Ubiquitination of UVRAG by SMURF1 promotes autophagosome maturation and inhibits hepatocellular carcinoma growth. Autophagy. 15 (7), 1130-1149 (2019).
  20. Qin, X., et al. Identification of an autoinhibitory, mitophagy-inducing peptide derived from the transmembrane domain of USP30. Autophagy. 18 (9), 2178-2197 (2022).
  21. Borodovsky, A., et al. Chemistry-based functional proteomics reveals novel members of the deubiquitinating enzyme family. Chem Biol. 9 (10), 1149-1159 (2002).
  22. Ovaa, H. Active-site directed probes to report enzymatic action in the ubiquitin proteasome system. Nat Rev Cancer. 7 (8), 613-620 (2007).
  23. Ekkebus, R., Flierman, D., Geurink, P. P., Ovaa, H. Catching a dub in the act: Novel ubiquitin-based active site-directed probes. Curr Opin Chem Biol. 23, 63-70 (2014).
  24. D'arcy, P., et al. Inhibition of proteasome deubiquitinating activity as a new cancer therapy. Nat Med. 17 (12), 1636-1640 (2011).
  25. Sucher, N. J. The application of Chinese medicine to novel drug discovery. Expert Opin DrugDiscov. 8 (1), 21-34 (2013).
  26. Jung, I., Kim, H., Moon, S., Lee, H., Kim, B. Overview of salvia miltiorrhiza as a potential therapeutic agent for various diseases: An update on efficacy and mechanisms of action. Antioxidants (Basel). 9 (9), 857 (2020).
  27. Wang, Z., Peters, R. J. Tanshinones: Leading the way into lamiaceae labdane-related diterpenoid biosynthesis. Curr Opin Plant Biol. 66, 102189 (2022).
  28. Bai, M., et al. Astrocytes and microglia-targeted danshensu liposomes enhance the therapeutic effects on cerebral ischemia-reperfusion injury. J Control Release. 364, 473-489 (2023).
  29. Zhang, H., et al. Salvianolic acid a protects RPE cells against oxidative stress through activation of Nrf2/HO-1 signaling. Free Radic Biol Med. 69, 219-228 (2014).
  30. Wang, R., et al. Danshensu inhibits sars-cov-2 by targeting its main protease as a specific covalent inhibitor and discovery of bifunctional compounds eliciting antiviral and anti-inflammatory activity. Int J Biol Macromol. 257 (Pt 2), 128623 (2024).
  31. Misaghi, S., et al. Structure of the ubiquitin hydrolase UCH-L3 complexed with a suicide substrate. J Biol Chem. 280 (2), 1512-1520 (2005).
  32. Wing, S. S. Deubiquitinating enzymes--the importance of driving in reverse along the ubiquitin-proteasome pathway. Int J Biochem Cell Biol. 35 (5), 590-605 (2003).
  33. Samy, M. A., Abd El Fatah, N. M., Yahia, S. E., Arafa, R. K. Friend or foe: UCHL3 mediated carcinogenesis and current approaches in small molecule inhibitors' development. Curr Med Chem. 28 (42), 8782-8799 (2021).
  34. Hafez, N., Modather El-Awadly, Z., Arafa, R. K. UCH-L3 structure and function: Insights about a promising drug target. Eur J Med Chem. 227, 113970 (2022).
  35. Song, Z., et al. A novel UCHL(3) inhibitor, perifosine, enhances PARP inhibitor cytotoxicity through inhibition of homologous recombination-mediated DNA double strand break repair. Cell Death Dis. 10 (3), 398 (2019).
  36. Hirayama, K., Aoki, S., Nishikawa, K., Matsumoto, T., Wada, K. Identification of novel chemical inhibitors for ubiquitin c-terminal hydrolase-L3 by virtual screening. Bioorg Med Chem. 15 (21), 6810-6818 (2007).
  37. Nijman, S. M., et al. A genomic and functional inventory of deubiquitinating enzymes. Cell. 123 (5), 773-786 (2005).
  38. Guo, M., et al. High-throughput screening for amyloid-β binding natural small-molecules based on the combinational use of biolayer interferometry and UHPLC-DAD-Q/TOF-MS/MS. Acta Pharm Sin B. 12 (4), 1723-1739 (2022).
  39. Chavanieu, A., Pugnière, M. Developments in spr fragment screening. Expert Opin Drug Discov. 11 (5), 489-499 (2016).
  40. Dai, L., et al. Horizontal cell biology: Monitoring global changes of protein interaction states with the proteome-wide cellular thermal shift assay (CETSA). Annu Rev Biochem. 88, 383-408 (2019).
  41. Pinzi, L., Rastelli, G. Molecular docking: Shifting paradigms in drug discovery. Int J Mol Sci. 20 (18), 4331 (2019).
  42. Shang, L., et al. Mechanism of Sijunzi decoction in the treatment of colorectal cancer based on network pharmacology and experimental validation. J Ethnopharmacol. 302 (Pt A), 115876 (2023).
  43. Fan, Z., Wang, S., Xu, C., Yang, J., Cui, B. Mechanisms of action of fu fang gang liu liquid in treating condyloma acuminatum by network pharmacology and experimental validation. BMC Complement Med Ther. 23 (1), 128 (2023).
  44. Tirat, A., et al. Synthesis and characterization of fluorescent ubiquitin derivatives as highly sensitive substrates for the deubiquitinating enzymes UCH-L3 and USP-2. Anal Biochem. 343 (2), 244-255 (2005).
  45. Hassiepen, U., et al. A sensitive fluorescence intensity assay for deubiquitinating proteases using ubiquitin-rhodamine110-glycine as substrate. Anal Biochem. 371 (2), 201-207 (2007).
  46. Chan, W. C., et al. Accelerating inhibitor discovery for deubiquitinating enzymes. Nat Commun. 14 (1), 686 (2023).
  47. Haj-Yahya, N., et al. Dehydroalanine-based diubiquitin activity probes. Org Lett. 16 (2), 540-543 (2014).
  48. Li, G., Liang, Q., Gong, P., Tencer, A. H., Zhuang, Z. Activity-based diubiquitin probes for elucidating the linkage specificity of deubiquitinating enzymes. Chem Commun (Camb). 50 (2), 216-218 (2014).

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