アブラナ属の低酸素耐性を研究するためのキャベツプロトプラストシステムの開発

要約

このプロトコルは、効率的なキャベツ葉肉プロトプラストシステムについて説明しています。さまざまな酸素欠乏治療が試験され、システムは低酸素反応性遺伝子の高い活性化を示し、 アブラナ科 野菜の洪水耐性の遺伝的および分子的メカニズムの研究を促進しました。

要約

気候変動が大雨をもたらす中、 アブラナ科 の主要な野菜であるキャベツは、洪水による低酸素ストレスにより、大幅な収量減少に直面しています。キャベツの氾濫耐性のメカニズムを特定するには、キャベツの形質転換難性を克服するための遺伝的機能研究のための汎用性の高いプラットフォームが必要です。この研究では、キャベツのプロトプラスト一過性発現システムとそれに対応するプロトプラスト低酸素誘導プロトコルが開発されました。このプロトコールは、キャベツの葉からのプロトプラスト単離の高収率と完全性を達成し、最適化された酵素条件を使用してトランスフェクション効率が40%を超えました。治療前に低酸素の影響を軽減するために、W5溶液を酸素ガスで泡立てて溶存酸素レベルを上げました。EC-オキシラーゼ、オキシフルオール、亜硫酸ナトリウム、脱酸素パックなど、酸素レベルの調整と生理的酸素捕捉処理のためのいくつかの化学物質が試験されました。デュアルルシフェラーゼアッセイでは、キャベツのプロトプラストで嫌気性呼吸応答遺伝子 BoADH1 および BoSUS1L のプロモーターが低酸素治療後に活性化され、脱酸素パックによる処理後に最も高い誘導レベルが観察されることが示されました。要約すると、キャベツのプロトプラスト一過性発現システムと低酸素治療の組み合わせは、効率的で便利なプラットフォームを示しています。このプラットフォームは、キャベツの低酸素応答に関連する遺伝子機能と分子メカニズムの研究を容易にすることができます。

概要

地球規模の気候変動は洪水を悪化させ、世界中でますます重要な問題として浮上しています。ここ数十年で洪水の頻度が増加傾向にあり、その結果、作物の大幅な損失が発生しています^1,2。キャベツ(Brassica oleracea var. capitata L.)は、世界的に重要な野菜ですが、大雨の悪影響を受けやすいため、極端な気象現象に直面しても持続可能な生産を確保するためには、洪水に強いキャベツ品種の開発が必要です。したがって、キャベツの浸水ストレスに関連する分子メカニズムを理解することは、この課題に対処するために不可欠です。

水没条件下での植物の遺伝子制御メカニズムを理解するために、トランスジェニック系統は遺伝機能研究に広く使用されています。しかし、このアプローチは、高コスト、時間のかかる形質転換、継代培養のプロセス、および多くの作物種での形質転換効率の低さによって制約を受けており、代替の方法論の開発が必要です。プロトプラストベースの一過性発現システムは、汎用性と効率性に優れた代替手段として、植物分子研究に広く応用されています。これらのシステムは、プロモーター活性、環境手がかりに応答したシグナル伝達経路、タンパク質-タンパク質またはタンパク質-DNA相互作用、お....

プロトコル

この研究では、2つの市販のキャベツ品種(B. oleracea var. capitata)、「冬鳥」と「228」が利用されました。プロトコルワークフローを図 1に示します。本試験で使用した試薬および装置の詳細は、 材料表に記載されています。

1.キャベツの苗の準備

1. 48ウェルプラグトレイ(L 49 cm x W 28 cm x H 5 cm)の丸い正方形の穴(D 4.5 cm x H 4.5 cm)に、市販の植物基質を使用して「フユドリ」と「228」のキャベツの種を播種します。種子を成長培地に約1cmの深さで埋め込みます。
2. キャベツの苗を22°Cの成長室で、16/8時間の明暗サイクルで育てます。光相中は、100 μmol ^m-2·^s-1 (白色蛍光管)の光強度を維持します。
3. 成長の2〜3週間後、葉肉のプロトプラストをさらに分離するために、2葉の段階でキャベツの苗を使用します。
   注:キャベツの苗の推奨サイズは、2枚目の本葉が完全に拡大されますが、3番目の本葉は拡大されず、その長さが1 cmより短い2葉の段階です(

結果

この研究では、キャベツのプロトプラストを利用した一過性発現システムの開発に成功しました(ワークフローについては図1を参照)。プロトプラストは、セルラーゼ/マセロチーム消化と暗真空浸潤(図2B、C)を使用して、市販のキャベツ品種「ふゆどり」および「228」から適切なサイズの2〜3週齢のキャベツ本?.......

ディスカッション

このプロトコルは、2つの市販のキャベツ品種からのプロトプラスト単離のための合理化された方法を提供します。この分析法の有効性は、主に、生存可能なプロトプラストの収量とプロトプラストトランスフェクションの効率という2つの重要な品質管理パラメーターを通じて評価されます。このプロトコルの実施により、4.00 x 10⁶ protoplasts·g⁻¹·両?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-(N-morpholino) ethanesulfonic Acid (MES)	PhytoTech Labs	M825	For enzyme solution preparation
228 cabbage seeds	Takii & Co., Ltd. (Kyoto, Japan)
50 mL Conical Tube	SPL Life Sciences	50050	For enzyme solution preparation
6-well tissue culture plate	Alpha Plus	16106	For protoplast incubation
70 μm cell strainer	Sorfa	SCS701	For protoplast filtration
9-cm Petri dish	Alpha Plus	16001	For enzymatic digestion
Anaerobic jar	HIMEDIA	Anaerobic Jar 3.5 L	For hypoxia treatment
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906	For W5 solution preparation and culture plate coating
Calcium chloride	J.T.Baker	131301	For W5 solution and PEG solution preparation
Cellulase R10	Yakult		For enzyme solution preparation
Desiccator	Tarsons	402030	For vacuum infiltration
D-Glucose	Bioshop	GLU501	For W5 solution preparation
Dissolved oxygen meter	Thermo Scientific	Orion Star A223	For oxygen measurement
D-Mannitol	Sigma-Aldrich	M1902	For enzyme solution, PEG solution, and MMG solution preparation
Dual-Luciferase Reporter Assay System	Promega	E1960	For Dual-luciferase reporter assay
EC-Oxyrase	Oxyrase Inc.	EC-0005	For hypoxia treatment
Fuyudori cabbage seeds	Kobayashi Seed Co., Ltd. (Kakogawashi, Japan)
High-Speed refrigerated centrifuge	Hitachi	CR21GIII	For protoplast harvest
Macerozyme R10	Yakult		For enzyme solution preparation
Magnesium chloride	Alfa Aesar	12315	For MMG solution preparation
Microcentrifuge	Hitachi	CT15RE	For protoplast harvest
Microplate	Greiner	655075	For Dual-luciferase reporter assay
Microplate Reader	Molecular Devices	SpectraMax Mini	For Dual-luciferase reporter assay
Millex 0.22 μm syringe filter	Merck	SLGP033RS	For enzyme solution preparation
Oil Free Vacuum Pump	Rocker	Rocker 300	For vacuum infiltration
OxyFluor	Oxyrase Inc.	OF-0005	For hypoxia treatment
Oxygen absorber pack	Mitsubishi Gas Chemical Company	AnaeroPack, MGCC1	For hypoxia treatment
Oxygen concentrator	UTMOST PERFECT	AII-X	For oxygen-bubbling in W5 solution
Plant substrate	Klasmann-Deilmann	Potgrond H substrate	For cabbage seedlings preparation
Plasmid Midi Kit	QIAGEN	12145	For purification of transfection-grade plasmid DNA
Polyethylene Glycol 4000	Fluka	81240	For protoplast transfection
Potassium chloride	J.T.Baker	304001	For W5 solution preparation
Razor blade	Gillette		For cabbage leaf strips preparation
Sodium chloride	Bioshop	SOD002	For W5 solution preparation
Sodium sulfite	Sigma-Aldrich	S0505	For hypoxia treatment
Water Bath	Yihder	BU-240D	For enzyme solution preparation