アブラナ属の低酸素耐性を研究するためのキャベツプロトプラストシステムの開発

要約

このプロトコルは、効率的なキャベツ葉肉プロトプラストシステムについて説明しています。さまざまな酸素欠乏治療が試験され、システムは低酸素反応性遺伝子の高い活性化を示し、 アブラナ科 野菜の洪水耐性の遺伝的および分子的メカニズムの研究を促進しました。

要約

気候変動が大雨をもたらす中、 アブラナ科 の主要な野菜であるキャベツは、洪水による低酸素ストレスにより、大幅な収量減少に直面しています。キャベツの氾濫耐性のメカニズムを特定するには、キャベツの形質転換難性を克服するための遺伝的機能研究のための汎用性の高いプラットフォームが必要です。この研究では、キャベツのプロトプラスト一過性発現システムとそれに対応するプロトプラスト低酸素誘導プロトコルが開発されました。このプロトコールは、キャベツの葉からのプロトプラスト単離の高収率と完全性を達成し、最適化された酵素条件を使用してトランスフェクション効率が40%を超えました。治療前に低酸素の影響を軽減するために、W5溶液を酸素ガスで泡立てて溶存酸素レベルを上げました。EC-オキシラーゼ、オキシフルオール、亜硫酸ナトリウム、脱酸素パックなど、酸素レベルの調整と生理的酸素捕捉処理のためのいくつかの化学物質が試験されました。デュアルルシフェラーゼアッセイでは、キャベツのプロトプラストで嫌気性呼吸応答遺伝子 BoADH1 および BoSUS1L のプロモーターが低酸素治療後に活性化され、脱酸素パックによる処理後に最も高い誘導レベルが観察されることが示されました。要約すると、キャベツのプロトプラスト一過性発現システムと低酸素治療の組み合わせは、効率的で便利なプラットフォームを示しています。このプラットフォームは、キャベツの低酸素応答に関連する遺伝子機能と分子メカニズムの研究を容易にすることができます。

概要

地球規模の気候変動は洪水を悪化させ、世界中でますます重要な問題として浮上しています。ここ数十年で洪水の頻度が増加傾向にあり、その結果、作物の大幅な損失が発生しています^1,2。キャベツ(Brassica oleracea var. capitata L.)は、世界的に重要な野菜ですが、大雨の悪影響を受けやすいため、極端な気象現象に直面しても持続可能な生産を確保するためには、洪水に強いキャベツ品種の開発が必要です。したがって、キャベツの浸水ストレスに関連する分子メカニズムを理解することは、この課題に対処するために不可欠です。

水没条件下での植物の遺伝子制御メカニズムを理解するために、トランスジェニック系統は遺伝機能研究に広く使用されています。しかし、このアプローチは、高コスト、時間のかかる形質転換、継代培養のプロセス、および多くの作物種での形質転換効率の低さによって制約を受けており、代替の方法論の開発が必要です。プロトプラストベースの一過性発現システムは、汎用性と効率性に優れた代替手段として、植物分子研究に広く応用されています。これらのシステムは、プロモーター活性、環境手がかりに応答したシグナル伝達経路、タンパク質-タンパク質またはタンパク質-DNA相互作用、および細胞内局在の研究を容易にします³。プロトプラスト一過性発現系の確立は、モデル植物^4,5だけでなく、サトウキビ⁶、カーネーション⁷、胡蝶蘭⁸、ナス⁹などの経済的に重要な作物でも報告されている。さらに、これらのシステムは、Camellia oleifera¹⁰やPopulus trichocarpa¹¹などの木本植物に成功裏に実装されています。しかし、水没による低酸素ストレス下で葉物野菜を研究するためにプロトプラストシステムを適用するためのプロトコルは限られています。したがって、キャベツプロトプラスト一過性発現システムを使用して葉物野菜の低酸素応答を研究することに関心のある人のために、この研究で統合されたプロトコルが開発されました。

細胞レベルでの浸水誘発性低酸素応答を実行するために、低酸素環境をシミュレートするために、以前の研究ではいくつかの酸素捕捉方法が採用されてきました。これらには、EC-オキシラーゼ、オキシフルオール、亜硫酸ナトリウム、および酸素消費バッグの使用が含まれます。EC-オキシラーゼは、通常、ヒト細胞株¹²およびシロイヌナズナプロトプラスト¹³の嫌気性治療に使用されます。OxyFluorは、生細胞蛍光イメージング中の活性酸素種によって引き起こされる光退色を軽減するのに効果的であることがわかっています^14,15。亜硫酸ナトリウムは、線虫の嫌気性治療に用いられており¹⁶、最近では、イネのプロトプラストに、クロマチン免疫沈降(ChIP)アッセイ¹⁷などの技術と組み合わせて用いられている。主に嫌気性細菌培養¹⁸に使用される脱酸素パックは、嫌気性条件下でトウモロコシプロトプラストのZmPORB1プロモーターの活性化を誘導する有効性も実証されています¹⁹。

本研究は、キャベツのプロトプラスト単離と一過性発現のための強固なパイプラインを確立することを目的としています。その後、デュアルルシフェラーゼアッセイを用いて嫌気性応答遺伝子のプロモーター活性を評価することにより、様々な酸素調整治療の有効性を評価した。この研究で開発されたプロトコルは、 アブラナ属 のシステムの浸水または低酸素ストレスに関連する将来の研究にとって価値があると期待されています。

プロトコル

この研究では、2つの市販のキャベツ品種(B. oleracea var. capitata)、「冬鳥」と「228」が利用されました。プロトコルワークフローを図 1に示します。本試験で使用した試薬および装置の詳細は、 材料表に記載されています。

1.キャベツの苗の準備

1. 48ウェルプラグトレイ(L 49 cm x W 28 cm x H 5 cm)の丸い正方形の穴(D 4.5 cm x H 4.5 cm)に、市販の植物基質を使用して「フユドリ」と「228」のキャベツの種を播種します。種子を成長培地に約1cmの深さで埋め込みます。
2. キャベツの苗を22°Cの成長室で、16/8時間の明暗サイクルで育てます。光相中は、100 μmol ^m-2·^s-1 (白色蛍光管)の光強度を維持します。
3. 成長の2〜3週間後、葉肉のプロトプラストをさらに分離するために、2葉の段階でキャベツの苗を使用します。
   注:キャベツの苗の推奨サイズは、2枚目の本葉が完全に拡大されますが、3番目の本葉は拡大されず、その長さが1 cmより短い2葉の段階です(図2A)。キャベツの苗の発育段階を同期させるためには、「ふゆどり」の種子は成長速度が異なるため、「228」の種子よりも約2日早く播種する必要があります。この調整により、キャベツ植物間の望ましい段階での均一な成長と成熟が保証されます。

2.キャベツプロトプラストの分離

1. 各プロトプラスト単離の前に、12.5 mLの酵素溶液(表1)を調製します。
   1. 10 mM MES(pH 5.7)と0.6 Mのマンニトールを含む溶液を55°Cで予熱します。 1.5%セルラーゼR10と0.75%マセロチームR10を添加した後、溶液を55°Cで10分間温め続けます。
   2. 酵素溶液が室温(25°C)まで冷えた後、10 mMのCaCl₂ と0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)を加えます。調製した酵素溶液を0.22μmシリンジフィルターを用いて9cmのシャーレにフィルター滅菌します。
      注:溶液を事前に加温すると、酵素の溶解度が高まり、プロテアーゼが不活性化されます。消化効果は、セルラーゼ酵素の種類によって異なります。セルラーゼR10とマセロチームR10の組み合わせは、キャベツのプロトプラストの単離に適しています。
2. 5〜8本のキャベツの苗から2番目の新しく拡大した本葉を集め、鋭利なカミソリの刃を使用して0.5〜1.0mmのストリップにスライスします。すぐに葉のストリップを新しく調製した酵素溶液に移します。
   注:適切な段階でキャベツから健康で指定された葉を選択することが重要です。2葉期のキャベツ苗から新たに拡大した2枚目の本葉は、最も高いプロトプラスト分離効率を提供します。過度に成熟した植物、子葉、または老化した葉は、プロトプラストの単離には推奨されません。5〜12枚の十分に拡大した本葉は、12.5mLの酵素溶液でキャベツのプロトプラストを成功裏に生成できます。プロトプラストの単離に必要な葉の数は、必要なプロトプラストの所望の量によって異なります。通常、5〜8枚の葉から得られるプロトプラストは、その後の実験手順に十分です。
3. 暗闇で30分間真空浸透した後(図2B)、キャベツの葉のストリップを酵素溶液(図2C)に室温でさらに4〜16時間浸しておきます。
   注:酵素消化時間はキャベツの品種によって異なる場合があり、特定の遺伝子型に応じて最適化する必要があります。例えば、「フユドリ」は「フユドリ」の葉が厚いため、「228時間」(4時間)に比べて消化時間が長くなります(16時間)。
4. プロトプラスト含有溶液を等量のW5溶液(2 mMのMES(pH 5.7)、154 mMのNaCl、125 mMのCaCl₂、5 mMのKCl、および5 mMのグルコース(調製については 表1 を参照)で希釈し、酵素消化を停止します。
5. プロトプラスト懸濁液を緩やかに旋回させるか、オービタルシェーカーを使用して放出します。細胞懸濁液を70 μmの細胞ストレーナーで50 mLのコニカルチューブにろ過します。
   注:単離されたプロトプラストは70μmの細胞ストレーナーを通過することができますが、未消化の植物破片はストレーナーによって保持され、その後懸濁液から除去されます。セルストレーナーは、洗浄後も再利用して75%エタノールで保持することができますが、セルストレーナーをW5溶液で十分にすすいで残留エタノールを除去する必要があります。
6. プロトプラスト溶液を150 x g で4°Cで2分間遠心分離し、上清を慎重に取り除きます。ペレット状にしたプロトプラストを、コニカルチューブの壁に沿って約1mLの流量で10mLのW5溶液を加えて、穏やかに洗浄^します。チューブを150 x g で4°Cで2分間遠心分離し、この洗浄手順を再度繰り返して、酵素溶液が完全に除去されるようにします。
7. プロトプラストをW5溶液に再懸濁し、氷上に30分間置きます。アイスインキュベーション後、すべての上清が除去されるまで、ピペットで一度に1mLずつ上清を取り除きます。
8. 4 mMのMES(pH 5.7)、0.4 Mのマンニトール、および15 mMのMgCl₂ からなる氷で予冷したMMG溶液にプロトプラストを再懸濁します(調製については 表1 を参照)。
9. 血球計算盤でプロトプラスト濃度を測定し、MMG溶液を用いて最終濃度を4×10⁵ プロトプラスト・^mL-1 に調整します。

3. プロトプラストトランスフェクション

1. 総容量10 μLのプラスミド (5-10 μg) (補足ファイル1) と100 μLのプロトプラスト (4 x 10⁴ プロトプラスト) を混合し、氷上に10分間置きます。
   注:トランスフェクショングレードのプラスミド精製には、製造元の指示に従って市販のプラスミドキットを使用します。約4 x 10⁴ プロトプラストは、通常、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイで使用されます。より大規模な実験では、トランスフェクションに利用できるプロトプラストの量が多くなります。具体的には、10 μgのプラスミドをトランスフェクトした約2 x 10⁵ プロトプラストは、30%から40%の範囲のトランスフェクション効率が実証されています。
2. 40%ポリエチレングリコール4000(PEG4000)、0.1 MのCaCl₂、および0.2 Mのマンニトールを含む等量(110 μL)の新たに調製したPEG溶液(調製については表1を参照)をプロトプラスト溶液に同量(110 μL)加え、穏やかに混合します。
3. プロトプラスト混合物を室温で暗所で10分間インキュベートし、その後、440μLのW5溶液を加えて反応を終了します。
4. トランスフェクションしたプロトプラストを150 x g で2分間、4°Cで遠心分離し、ペレットを750 μLの酸素富化W5溶液に再懸濁します。再懸濁したプロトプラストを、1% BSAでプレコートした6ウェル組織培養プレートに移します。
   注:細胞インキュベーションに使用するW5溶液は、エアストーンに接続された酸素濃縮器(~90%酸素)を使用して酸素で5分間泡立てる必要があります(図2D)。この酸素化プロセスの後、W5溶液中の最終的な溶存酸素濃度は7.84 mg·^L-1 ± 0.05 mg·^L-1 から29.18mg·^L-1 ± 0.43 mg·^L-1、溶存酸素計で測定した値。トランスフェクションされたプロトプラストの再懸濁のためのW5溶液の量は、使用する組織細胞培養プレートの種類によって異なります。12ウェルまたは24ウェルの細胞培養プレートの場合、ウェル内の深さが深いため、インキュベーション中の低酸素ストレスを軽減するために、W5溶液の量を減らすことをお勧めします。BSAコーティングの場合、培養プレートの各ウェルに1 mLの1%BSA溶液を注入し、ウェルを10秒間コーティングしました。その後、BSA溶液を各ウェルから廃棄し、その後、ウェルにW5溶液を補充しました。この手順は、BSAを使用して一時的な非接着性表面を作成し、その後の実験ステップでプロトプラストが培養プレートのプラスチック表面に付着するのを効果的に防ぐことを目的としていました。

4. キャベツプロトプラストの低酸素治療

1. プロトプラストトランスフェクションの直後に化学的または物理的に誘発される低酸素治療を実施します。
   注:低酸素療法は、プロトプラストトランスフェクションの直後に適用することをお勧めします。.プロトプラストのインキュベーションを長期間行うと、その後の低酸素反応が減少する可能性があります。
   1. キャベツのプロトプラストに化学的に誘発された低酸素症の場合は、OxyFluor、EC-オキシラーゼ、および亜硫酸ナトリウムをW5プロトプラスト溶液に加えます。.
      注:W5に0.6単位・^mL-1 EC-オキシラーゼ、0.6単位・^mL-1 OxyFluor、および1 g・^mL-1 亜硫酸ナトリウムを使用した場合、調査した2種類のキャベツで BoADH1 および BoSUS1L プロモーター(図3A)を誘導し、プロトプラストの完全性を低く抑えることができる試験条件でした。
   2. 酸素を消費するバッグ誘発性低酸素症の場合は、3.5Lの嫌気性ジャーに2つの脱酸素パックを入れて、低酸素環境を作り出します。
2. 低酸素処理されたプロトプラストを回収するには、150 x g で4°Cで2分間遠心分離します。 採取したプロトプラストを液体窒素で凍結し、その後のアッセイのために-80°Cの冷凍庫で保存します。

5. デュアルルシフェラーゼアッセイ

1. デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイは、製造元の指示に従って、わずかな変更を加えて実施します。
   1. キャベツのプロトプラストを50 μLの1x Passive Lysis Bufferに再懸濁し、ボルテックスで10秒間放置します。
   2. 破壊されたプロトプラストを氷上で10分間インキュベートし、10,000 x g で4°Cで10分間遠心分離した後、上清を回収します。
   3. 20 μLの細胞ライセートをマイクロプレートの各ウェルに加えます。100 μLのルシフェラーゼアッセイ試薬IIをウェルに分注し、マイクロプレートリーダーを使用してホタルルシフェラーゼ活性を測定します。
   4. 市販のアッセイ試薬100 μLを各ウェルに加え、マイクロプレートリーダーを使用してRenillaルシフェラーゼ活性を測定します。

結果

この研究では、キャベツのプロトプラストを利用した一過性発現システムの開発に成功しました(ワークフローについては図1を参照)。プロトプラストは、セルラーゼ/マセロチーム消化と暗真空浸潤(図2B、C)を使用して、市販のキャベツ品種「ふゆどり」および「228」から適切なサイズの2〜3週齢のキャベツ本?...

ディスカッション

このプロトコルは、2つの市販のキャベツ品種からのプロトプラスト単離のための合理化された方法を提供します。この分析法の有効性は、主に、生存可能なプロトプラストの収量とプロトプラストトランスフェクションの効率という2つの重要な品質管理パラメーターを通じて評価されます。このプロトコルの実施により、4.00 x 10⁶ protoplasts·g⁻¹·両?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-(N-morpholino) ethanesulfonic Acid (MES)	PhytoTech Labs	M825	For enzyme solution preparation
228 cabbage seeds	Takii & Co., Ltd. (Kyoto, Japan)
50 mL Conical Tube	SPL Life Sciences	50050	For enzyme solution preparation
6-well tissue culture plate	Alpha Plus	16106	For protoplast incubation
70 μm cell strainer	Sorfa	SCS701	For protoplast filtration
9-cm Petri dish	Alpha Plus	16001	For enzymatic digestion
Anaerobic jar	HIMEDIA	Anaerobic Jar 3.5 L	For hypoxia treatment
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906	For W5 solution preparation and culture plate coating
Calcium chloride	J.T.Baker	131301	For W5 solution and PEG solution preparation
Cellulase R10	Yakult		For enzyme solution preparation
Desiccator	Tarsons	402030	For vacuum infiltration
D-Glucose	Bioshop	GLU501	For W5 solution preparation
Dissolved oxygen meter	Thermo Scientific	Orion Star A223	For oxygen measurement
D-Mannitol	Sigma-Aldrich	M1902	For enzyme solution, PEG solution, and MMG solution preparation
Dual-Luciferase Reporter Assay System	Promega	E1960	For Dual-luciferase reporter assay
EC-Oxyrase	Oxyrase Inc.	EC-0005	For hypoxia treatment
Fuyudori cabbage seeds	Kobayashi Seed Co., Ltd. (Kakogawashi, Japan)
High-Speed refrigerated centrifuge	Hitachi	CR21GIII	For protoplast harvest
Macerozyme R10	Yakult		For enzyme solution preparation
Magnesium chloride	Alfa Aesar	12315	For MMG solution preparation
Microcentrifuge	Hitachi	CT15RE	For protoplast harvest
Microplate	Greiner	655075	For Dual-luciferase reporter assay
Microplate Reader	Molecular Devices	SpectraMax Mini	For Dual-luciferase reporter assay
Millex 0.22 μm syringe filter	Merck	SLGP033RS	For enzyme solution preparation
Oil Free Vacuum Pump	Rocker	Rocker 300	For vacuum infiltration
OxyFluor	Oxyrase Inc.	OF-0005	For hypoxia treatment
Oxygen absorber pack	Mitsubishi Gas Chemical Company	AnaeroPack, MGCC1	For hypoxia treatment
Oxygen concentrator	UTMOST PERFECT	AII-X	For oxygen-bubbling in W5 solution
Plant substrate	Klasmann-Deilmann	Potgrond H substrate	For cabbage seedlings preparation
Plasmid Midi Kit	QIAGEN	12145	For purification of transfection-grade plasmid DNA
Polyethylene Glycol 4000	Fluka	81240	For protoplast transfection
Potassium chloride	J.T.Baker	304001	For W5 solution preparation
Razor blade	Gillette		For cabbage leaf strips preparation
Sodium chloride	Bioshop	SOD002	For W5 solution preparation
Sodium sulfite	Sigma-Aldrich	S0505	For hypoxia treatment
Water Bath	Yihder	BU-240D	For enzyme solution preparation