遺伝子機能研究のためのスライスヒト皮質オルガノイドのエレクトロポレーション

要約

ここでは、エレクトロポレーションによるスライスされたヒト皮質オルガノイドの急性遺伝子操作について紹介します。これらの皮質オルガノイドモデルは、スライス後に心室のような構造を容易に特定できるため、特に注射に適しており、ヒトの皮質発達、神経発達障害、および皮質進化の機能的研究を可能にします。

要約

ヒト皮質オルガノイドは、ヒトの脳の発達、神経発達障害、およびヒトの脳の進化を研究するための重要なツールとなっています。過剰発現またはノックアウトによる遺伝子機能の解析は、新皮質発生の調節に関するメカニズムの洞察を提供する動物モデルに役立っています。ここでは、スライスしたヒト皮質オルガノイドのエレクトロポレーションによるCRISPR/Cas9を介した急性遺伝子ノックアウトの詳細なプロトコールを紹介します。皮質オルガノイドのスライスは、注射およびその後のエレクトロポレーションのための心室様構造の同定に役立ち、これをヒト皮質発生中の急性遺伝子操作に特に適したモデルにします。ガイドRNAの設計と、 in vitro および皮質オルガノイドにおけるターゲティング効率の検証について説明します。皮質オルガノイドのエレクトロポレーションは、神経原性中期に行われ、頂端橈骨グリア、基底前駆細胞、ニューロンなど、発生中の新皮質のほとんどの主要な細胞クラスを標的化することができます。まとめると、スライスしたヒト皮質オルガノイドのエレクトロポレーションは、皮質発生中の遺伝子機能、遺伝子調節、および細胞形態を調査するための強力な技術を表しています。

概要

新皮質とは、大脳半球の外側を覆うものを指し、哺乳類に特有の構造です。新皮質は、高次認知機能の座を表しています1,2,3,4,5。発生中、神経幹細胞と前駆細胞は、ニューロン新生と呼ばれるプロセスでニューロンを生じさせます。ヒト新皮質の発達を研究する機能的研究は、ヒト神経幹細胞の調節、神経病理、およびヒトの脳進化の根底にあるメカニズムを解明するための基礎を提供します^2,6,7。

歴史的に、ヒトの脳の発達に関する研究は、死後組織を用いた記述的な組織学的アプローチに依存しており、最近では、ヒト胎児組織を用いた機能的研究を可能にするフリーフローティング組織培養システムを用いている^8,9。さらに、ヒ....

プロトコル

ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)を含むすべての実験は、1964年のヘルシンキ宣言に概説された倫理基準に従って実施され、ドレスデン大学病院倫理審査委員会(IRB00001473;IORG0001076;倫理承認番号 SR-EK-456092021)。

1. 急性CRISPR/Cas9を介した遺伝子ノックアウトのためのガイドRNAの設計

1. ソフトウェアやオンラインツールを使用して、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)間の距離が理想的には7〜11 bp(3 bpの倍数を避ける)で同じエクソンを標的とするガイドRNA(gRNA)のペアを設計し、タンパク質破壊の可能性を高めます。
   注:理想的には、機能ドメインをコードするエクソンを標的とすべきです。あるいは、転写産物の最初のエクソンを選択することもできます(図1A)。ガイドRNAは、活性スコア(1に近い)⁵⁷ および特異度スコア(100%に近い⁾⁵⁸に基づいて選択します。

2. ヒト人工多能性幹細胞の培養

1. ヒト皮質オルガノイド....

結果

CRISPR/Cas9を介した遺伝子アブレーションには、gRNAの設計が必要です。一般に、目的の遺伝子の最初のエクソンの1つを、7〜11 bpの間隔で配置したgRNAのペアで標的とすると(3 bpの倍数を避ける)、うまく機能します(図1A)。第1の試験として、gRNAによるテンプレート認識の効率は、PCRテンプレート26,40,62を用いて^.......

ディスカッション

ヒトの脳オルガノイドと皮質オルガノイドは、ヒトの新皮質の発達を研究するための重要なモデルとなっている^7,16,17。ヒト疾患のモデリングでは、アイソジェニックなhiPSC株とオルガノイドがゴールドスタンダードとなっています⁶⁸。しかし、新規iPS細胞株の作製には時間と費用.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL PP Centrifuge Tubes, conical	Corning	430791
4D-Nucleofector Core Unit	Lonza
4D-Nucleofector X Unit	Lonza
5 mL polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap	Corning	Falcon 352235
6-well plate, nunclon treated	Thermo Fisher	140675	For hiPSC culture
6-well plate, ultra low attachment	Corning	3471	For organoid culture
A83-01	STEMCELL Technologies	72022	Forebrain medium 1 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Air compressor	Aerotec
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H+L)	Jackson Immuno Research	703-545-155	Secondary antibody, RRID: AB_2340375; dilution 1:1000
Alexa Fluor 555 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A-31572	Secondary antibody, RRID: AB_162543; dilution 1:1000
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA, 2 nmol	Integrated DNA technologies		Custom design (order as 2 nmol)
Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA	Integrated DNA technologies	1072532	5 nmol
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3	Integrated DNA technologies	1081060	100 µg, from Streptococcus pyogenes
Amphotericin B (Fungizone)	Gibco	15290018	Forebrain medium 2, 3, and 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Anti-GFP primary antibody (chicken, polyclonal)	Abcam	ab13970	RRID: AB_300798; dilution 1:2000
Anti-PCGF4 primary antibody (mouse, monoclonal)	Millipore	05-637	RRID: AB_309865; dilution 1:300
ApoTome fluorescent microscope	Zeiss
Ascorbic Acid	Sigma Aldrich	1043003	Forebrain medium 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
B27-supplement (+ vitamin A)	Gibco	17504044	Forebrain medium 3, 4   (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Banana to Micrograbber Cable Kit	Harvard Apparatus BTX	45-0216
Biometra TRIO-Thermocycler (PCR machine)	Analytik Jena	846-2-070-723
Capillaries, borosilicate glass with filament, OD 1.2 mm; ID 0.69 mm; 10 cm length	Science Products	BF120-69-10	Need to be pulled to specific thickness
CHIR-99021	STEMCELL Technologies	72052	Forebrain medium 2  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Collagenase Type IV	Gibco	17104019
CRTDi004-A	Stem Cell Engineering Facility at CMCB DD	https://hpscreg.eu/cell-line/CRTDi004-A	Single-cell adapted hiPSC line from healthy donor
DAPI	Roche	10236276001	1 mg/mL stock, use 1:1000 diluted for IF
Dibutyryl-cAMP	STEMCELL Technologies	73884	Forebrain medium 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	D2650
DMEM/F-12, HEPES	Fisher Scientific	31330095	Forebrain medium 1, 2, and 3  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Dorsomorphin	STEMCELL Technologies	72102	Forebrain medium 1  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Dumont #55 Forceps, straigth, 11 cm	Fine Science Tools	11295-51
ECM 830 Square Wave Electroporation System	Harvard Apparatus BTX	45-2052
Ethanol	Sigma Aldrich	32205-1L-M
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich	EDS-500G
Fast Green FCF	Sigma Aldrich	F7252
Fetal Bovine Serum (FBS)	GE Healthcare	SH30070.03
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	P-97	For pulling of microcapillaries
Geneious Prime	GraphPad Software LLC d.b.a Geneious	Software version 2024.0.5
gLACZ	Kalebic et al., 2016; Platt et al., 2014		5'-TGCGAATACGCCCACGCGATCGG; underlined nucleotides = PAM
GlutaMAX	Gibco	35050038	Forebrain medium 1, 2, 3, and 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Glycine	Sigma Aldrich	G8898
gPCGF4 KO1	this paper		5'-TGAACTTGGACATCACAAATAGG (corresponds to the KO images in Figure 3I+J)
gPCGF4 KO2	this paper		5'-ACAAATAGGACAATACTTGCTGG (corresponds to the KO images in Figure 3I+J)
HEPES	made in house		1 M stock
Horse Serum, heat-inactivated	Gibco	26050088
Human GDNF Recombinant Protein	Thermo Fisher	450-10	Forebrain medium 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Human/Mouse/Rat BDNF Recombinant Protein	Thermo Fisher	450-02	Forebrain medium 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Hydrochloric acid (HCl)	Sigma Aldrich	258148	To make TrisHCl
ImmEdge (wax) Pen	Vector Laboraories	H-4000
Insulin solution human	Sigma Aldrich	I9278	Forebrain medium 3  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Isopropanol	Fisher Scientific	BP2618-1
Knockout Serum Replacement	Gibco	10828-010	Forebrain medium 1  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Laser Scanning Confocal 980 Microscope	Zeiss
Low Melting Point Agarose, ultra pure	Thermo Fisher	16520100	for embedding of hCOs during vibratome sectioning
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-free	Corning	354230	For organoid culture
Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-free	Corning	354277	For hiPSC culture
MgCl2, 1 M	Thermo Fisher	AM9530G
Microinjector PicoPump + Foot Switch	World Precision Instruments	SYS-PV820
Microloader Pipette Tips 0.5 to 20 µL	Eppendorf	5242956003	For loading of glass capillaries
Mowiol 4-88	Sigma Aldrich	81381
mTeSR 1	STEMCELL Technologies	85850	Stem cell medium
N-2 supplement	Gibco	17502048	Forebrain medium 2, and 3  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
NaCl	Sigma Aldrich	S5886
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761
NEB Next High Fidelity 2x PCR Mastermix	New England Biolabs	M0541S
Neubauer counting chamber	Brand	718605
Neurobasal medium	Gibco	21103049	Forebrain medium 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Non-Essential Amino Acids	Gibco	11140050	Forebrain medium 1, 2, 3, and 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Nuclease-Free Duplex Buffer	Integrated DNA technologies	1072570
O. C. T. Compound	Tissue-Tek	4583	Embedding medium for frozen tissue specimen
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit S	Lonza	V4XP-3032
Paraformaldehyde	Fisher Chemical	P/0840/53
pCAG-GFP	Addgene	11150
Peel-A-Way Embedding Mold TruncatedT12	Polysciences Inc.	18986-1	For embedding of hCOs for vibratome and cryo-sectioning
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122	Forebrain medium 1, 2, 3, and 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 and for stem cell medium after nucleofection
Petri Dish 60 mm x 15 mm, No Vent, Sterile	Corning	BP50-02
Petri Dish Platinum Electrode Chamber, 5 mm gap	Harvard Apparatus BTX	45-0504
Phosphate buffered saline (PBS)	made in house
Proteinase K	Sigma Aldrich	P2308	From Titrachium album; 10 mg/mL stock
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28706
RHO/ROCK pathway inhibitor (Y-27632)	STEMCELL Technologies	72308
SB-431542	STEMCELL Technologies	72232	Forebrain medium 2  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Sodium Citrate Dihydrate	Sigma Aldrich	W302600-1KG-K
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Sigma Aldrich	L3771
Sucrose	Sigma Aldrich	S7903
SuperFrost Plus adhesion slides	Fisher Scientific	10149870
SZX10 with a KL 300 LED	Olympus	SZX10	Or alternative stereoscope
Thermo Shaker	Grant bio	PSC24N
Triton-X	Sigma Aldrich	T9284	a.k.a. Octoxinol 9
Trizma base	Sigma Aldrich	T1503	To make TrisHCl
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fisher	15250061
TrypLE Express Enzyme (1x)	Thermo Fisher	12604021	Dissociation enzmye to make single-cell suspensions
Tween 20	Sigma Aldrich	P1379	a.k.a. Polysorbate 20
Tyrode's salt	Sigma Aldrich	T2145-10x1l
Vibrating Microtome (vibratome)	Leica	VT1200 S
Wide-Bore 1000 µL Universal Fit Filter Tips	Corning	TF-1005-WB-R-S
β-Mercaptoethanol	Gibco	21985-023	Forebrain medium 1, 3, and 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15