ナノファイバー膜を用いた上皮細胞の三次元共培養モジュールの確立

要約

ここでは、ナノファイバー膜ベースの2層システムで線維芽細胞を培養した上皮細胞が、膜に安定して付着して増殖する様子を示します。

要約

上皮細胞の培養における技術的なハードルには、脱分化や機能の喪失などがあります。バイオミメティック3次元(3D)細胞培養法は、細胞培養の効率を高めることができます。本研究では、3次元環境下で線維芽細胞を培養し、上皮細胞を組織様層として培養することを目的とした先進的な2層培養システムを紹介する。ポリビニルアルコール(PVA)およびポリ(ε-カプロラクトン)(PCL)ナノ繊維膜(NM)は、エレクトロスピニングによって作製され、それぞれ上皮細胞および線維芽細胞の培養に生理学的に関連する細胞外マトリックスとして利用されました。上部インサートウェルでは、肺上皮細胞をPVA NMで培養し、下部チャンバーでは、線維芽細胞をPCL NMで培養しました。この構成により、細胞間直接の接触が排除され、可溶性因子によって媒介されるパラクリンシグナル伝達の検査が容易になります。共焦点顕微鏡法を用いて、上皮細胞の閉塞帯を含む細胞内タンパク質の分布、成長パターン、および発現を解析しました。Zスタッキング技術により、詳細な3D再構成が可能になり、上皮層内のタイトジャンクションと空間構成の完全性に関する正確な洞察が得られました。走査型電子顕微鏡(SEM)は、ナノファイバー膜上の細胞タイプの形態学的特性を評価しました。SEMイメージングにより、複雑な細胞表面構造とナノファイバーとの相互作用が明らかになり、細胞構造とナノファイバー構造との細胞相互作用に関する包括的な視点が得られました。Cell Counting Kit-8(CCK-8)アッセイは、上皮細胞および線維芽細胞の増殖速度を経時的に測定するための簡単な方法です。これは、これらの細胞を共培養することによる増殖挙動と潜在的な相乗効果を提供します。これらの知見は、上皮組織の再生、内皮細胞、免疫細胞、その他の間質細胞による腫瘍微小環境、毒性アッセイ、薬物活性試験など、さまざまな生理学的および薬理学的状況で重要な、線維芽細胞と上皮細胞の同時培養のための単純なインサート共培養システムの有効性を強調しています。

概要

何十年にもわたって、古典的な二次元(2D)単層培養は、感染症、薬理学、毒物学を理解するために不可欠でした^1,2。ただし、組織微小環境の複雑さ、マルチコンポジション間の動的相互作用、および3次元(3D)アーキテクチャを考慮することが重要です。したがって、2D細胞培養は、組織様構造を模倣することに限界がある^3,4。例えば、細胞間および細胞間マトリックス(ECM)シグナル伝達が欠如しており、これは生体内微小環境における細胞分化、増殖、細胞機能に不可欠です。これらの理由から、3D細胞培養のシステムが開発されてきました⁵。3D培養中の細胞は、周囲の細胞外マトリックスと3次元で増殖し、相互作用します。さらに、単純な単一細胞タイプのin vitroモデルとin vivo^で発生する動的な細胞相互作用との間のギャップを埋めるために、複数の細胞タイプで構成される3D共培養アプローチが開発されました6。3D共培養システムは、細胞間コミュニケーションおよび細胞-細胞外マトリックス(ECM)相互作用の研究で人気を博しています

プロトコル

1. 水安定性PVAナノファイバーの作製

1. ポリアクリル酸(PAA)0.02gとPVA1gを秤量し、磁気バーが入ったきれいなガラス瓶に入れます。ボトルに7.8mLの蒸留水を加え、ボトルをプレートスターラーに置き、温度を84°C、速度を500rpm、時間を12時間に設定します。
2. ボトルを室温まで冷ましてから、0.2 mLのグルタルアルデヒド(GA)を加えます。ボトルをプレートスターラーに置き、速度を500rpm、時間を30分、温度を室温に設定します。
3. エレクトロスピニングには5mLのシリンジを使用し、プランジャーをバレルから分離し、バレル内とプランジャーの先端の小さなプラスチックの破片を清掃します。
4. 針を使用して液体の流れを遮断し、PVA溶液を各バレルに注ぎます(容量:各2.5〜3 mL)。プランジャーを組み立ててから、針を取り外します。
   注:溶液に気泡がある可能性があるため、気泡が消えるまで待ちます。これには10〜30分かかります。
5. 新しい27Gの金属針を組み立て、エレクトロスピニングマシンに入れます。
6. コレクターをホイルでしっかりと包みます。
7. インジェクターパネルを元の位置に戻します。機械には次の設定を使用します:(各ポンプ)注入量:2 mL、注入速度:6 μL / min、ローラー....

結果

このプロトコルは、ナノファイバー膜ベースの2層モデルを構築することにより、MLE-12肺上皮細胞とNIH3T3線維芽細胞を共培養するための重要なステップを概説しています(図1)。このモデルは、共培養細胞の生細胞イメージング、免疫組織化学、およびエンドポイント定量分析に適しています。他の細胞型も、細胞密度および増殖条件を最適化す?.......

ディスカッション

2D培養モデルから3D培養モデルへの移行は、 in vitro 共培養モデルの開発における大きな進歩を表しています。3D培養モデルは、細胞が増殖、凝集、および分化できる組織微小環境を模倣する必要があります²²。スキャフォールドベースの3D共培養モデルを使用することで、組織構造の複製が強化されます。本研究では、NMベースのトランスウェ?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin/EDTA	Welgene	LS015-01
100x Penicilin/Streptomycin	Gibco	10378016
20x PBS	LPS solution	CBP007A
4% Paraformaldehyde	Biosesang	PC2031-050-00
Alexa Fluor-594 conjugated ZO-1 antibody	Invitrogen	339194
Antibody diluent OP Quanto	Epredia	10129-576
CCK-8 assay kit	Donginbio	CCK-3000
Cell culture dish (150x20)	SPL	20151
CellTracker Green CMFDA	Invitrogen	C7025
CellTracker Red CMTPX	Invitrogen	C34552
Chloroform	Samchun	C0584
Conical tube	SPL	50050
Cover glass	Corning	CLS2980245
DMEM high glucose	Welgene	LM001-05
DMEM/F12	Welgene	LM 002-05
DURAN Desiccator bases with plane flange, screw thread	DWK Life Sciences	7.022 260
DURAN Glass Desiccator Lid & Stopcock	Daihan Science	SM.2444061
DURAN Stopcock, with PTFE Spindle	DWK Life Sciences	10322671
Electrospinning machine	NanoNC	ESR200RD
Ethyl alcohol, Pure	Sigma Aldrich	459844
FBS	Sigma Aldrich	TMS-013-BKR
Fluorescence Laser Confocal Scanner Module K1-fluo	Nanoscope Systems
Gel/mount	Biomeda Corp.	M01
Glutaraldehyde solution	Sigma Aldrich	340855
Hoechst 33342	Invitrogen	H1399
Metal nozzle 27G	NanoNC
Nail polish	Nature republic
Normal goat serum	Vector Laboratories	S-1000
Osmium tetroxide	Sigma Aldrich	201030
Phalloidin-iFlour 488	abcam	ab176753
Plastic Syringe_Lure Lock (10 mL)	HENKE SASS WOLF	AL10
Poly(acrylic acid)	Sigma Aldrich	323667
Poly(vinyl alcohol)	Sigma Aldrich	341584
Polycaprolactone	Sigma Aldrich	440744
Pure HCL	Duksan	1129
Scanning Electron Microscopy	SEC	SNE-4500M
Slide glass	Marienfeld Superior	K15663717
Sylgard 184 set	omniscience	OMNI.05255
Synergy H1 Multimode Reader	Biotek
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100