上丘の表面上にフッ素金の適用により網膜神経節細胞の逆行性標識法

要約

このビデオでは、上丘（SC）の表面にフッ素金（FG）を適用することで、RGCの逆行性標識法の方法を説明します。テクニックは、頭蓋骨をドリル皮質を吸引し、SCの全体の背側表面上にゼラチンスポンジを適用する必要があります。

要約

網膜神経節細胞（RGC）計数は、特に緑内障の網膜変性を評価するために不可欠です。信頼性のRGCのラベリングは、任意の治療の効果を評価するための基本です。ラットでは、RGCsの約98％は対側上丘（SC）（フォレスターとピーターズ、1967）に投影することが知られている。我々は緑内障で、この最も脆弱な網膜神経細胞に集中できるように、SCの表面にフッ素金（FG）を適用することは、ほとんどすべてのRGCsにラベルを付けることができます。 FGは、網膜神経節細胞の軸索終末に取り込まれ、両側網膜におけるSOMAのために逆行性に輸送される。 2日間transected視神経の切り株でFGを入れておけば、RGCの逆行性標識法と比較し、RGC生存の干渉が最小限に抑えられます。汚れのRGCs、アマクリン細胞と網膜神経節細胞層での血管の内皮細胞は、この標識法はRGCに対してより特異的であることをクレシルバイオレット染色と比較してください。このビデオでは、SCの表面にFG適用することにより、RGCの逆行性標識法の方法を説明します。 SCを公開する皮質を吸引し、SCの全体の背側表面上にゼラチンスポンジを適用して表示され、外科的手技は、頭蓋骨をドリル含まれています。 SCの巨大な頭蓋内出血と誤嚥を避けるための有用なヒントが与えられている。

プロトコル

1. ケタミン（80mg/kg）とキシラジン（8mg/kg）（2:1体積比）の腹腔内注射によってラットをAnaesthetize。手術中に角膜の乾燥を防ぐために無菌の目の潤滑剤の軟膏を適用します。
2. 頭の毛皮を（目から耳のレベルに）ひげをそると、ヘッドクランプして、ヘッドステージにヘッドを固定し、切歯のバーでその歯を設定します。
3. 消毒操作の70％アルコールで10％のポビドンヨード溶液によるエリア。
4. 皮膚と頭蓋骨と縫合（矢状、冠状および横縫合）（図1）を公開する筋肉をカット。切開のエリアへのスプラッシュ（2 mg / kg体重を超えてはならない）として鎮痛剤、bupivicaineを適用します。
5. 矢状縫合の各側の頭蓋骨の穴（φ2 × 2 mmの矢状及び横縫合の両方から0.5mm）ドリル。髄膜の破裂や縫合糸の下に横たわって洞を避けてください。
   
   
   図1。生きているラットの頭蓋骨に特徴。
   
   
6. 春のはさみで髄膜を切り開く、涙を避ける。
7. 真空ポンプによって慎重に上丘の背側表面上に位置し、3つのチェックポイントを観察することができる脳のコンテンツを吸引除去する。
   1. 灰色から白に灰色の脳組織の色が変わります
   2. 無色の脳脊髄液が出てくる時に吸引を停止します
   3. 慎重に硬膜で覆わ黄色上丘を公開するために水平に最低吸引レベルを拡大
8. SCの4辺を直接顕微鏡で観察できるようになるまで、SC上の脳の内容を吸引除去する。削除された大脳皮質の部分は、望ましくない副作用（例えば、運動機能障害）を避けるために最小限に抑える必要があります。洞に触れないように注意してください。
9. できるだけSCの表面が乾いたように微細な滅菌綿のストライプで穴に水分を吸収する。その後、ゼラチンスポンジの薄層を配置し、事前に浸したSCの表面上に6％フルオロゴールド（FGは網膜神経節細胞の軸索末端で取り込まれ、両側網膜におけるSOMAのために逆行性に輸送される）と。
10. gelfoamで穴を埋め、縫合クリップで皮膚の傷を閉じます。
11. 動物は暖かい保つために白熱灯の下で回復させた。鎮痛、ブプレノルフィン（100mcg/kg）は、SCの標識後の5日間飲料水で経口適用されます。

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ディスカッション

1. なぜ網膜神経節細胞数のためにこの手術方法を使うのか？
   
   ラットでの網膜神経節細胞（RGC）の約98％は対側上丘（SC）に投影することが知られています。我々は緑内障で、この最も脆弱な網膜神経細胞に集中できるように、SCの表面にフッ素金を適用するには、RGCsのほぼすべてのラベルを付けることができます。 2日間transected視神経の切り株でFGを入れておけば、RGCの逆行性標識法と比較し、RGC?...

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