パッチピペットおよびプログラマブルプラーとシャープ電極作成

要約

このビデオでは、パッチピペットと電気生理学のためのシャープな電極を作るためにプログラム可能なプーラーを使用する方法を示します。同じ手順は、注射針を含む​​ガラスの様々なツールを、作るために使用することができます。

要約

ガラス微小電極は、（また、ピペットと呼ばれる）数十年の電気生理学の主力となっている。今日は、そのようなピペットは、プログラム可能なプーラーを用いてガラスキャピラリーから作られています。このような楽器の熱金属のフィラメントまたはレーザーと重力、モーターまたは両方を使用してガラスを引き出すのいずれかを使用してキャピラリー。細胞内記録のための鋭い電極は、熱、重力、そしてモーターを組み合わせて使用​​しながらのパッチクランプ記録用ピペットは、唯一の熱と重力を用いて形成される。細胞内記録ピペットを作るために使用される手順は、アフリカツメガエルの卵母細胞へのcRNAを注入などの様々なアプリケーションのための注射針を、作るために使用されているものと似ています。狭いガラスは細胞内記録（外径= 1.0 mm）のために使用されるが、一般的に、直径のガラスキャピラリー<1.2 mmの、パッチクランプ記録用ピペットを行うために使用されます。各ツールの場合、プーラーは若干異なってプログラムされています。このビデオでは、事前に確立されたプーラーのプログラムを使用して記録ピペットの両方の種類を作成する方法を示します。

プロトコル

引っ張っピペット

プラーなどサターP - 97火焔/ブラウンなどの微小電極を用いて、約10〜20ピペットのセットを引き出します。

1. あなたのガラスキャピラリーを選択してください。我々は、ホウケイ酸毛細血管（サターBF150 - 110 - 10、長い1.5ミリメートル外径さ1.1mm内径、10センチメートル）を使用します。それは自由な汚れやほこりを保つように慎重にガラスを保管​​してください。
2. 引っ張ってプログラムを設計します。我々は、各ステップで熱と速度を降順で、5段階のプログラムを使用し、そして最後のステップで小さなプル。サターのピペットの料理の本は、適切なプログラムを開発するための優れたリファレンスです。
3. 開口径と滑らかさを決定するために顕微鏡下でピペットチップを調べます。荒い、でこぼこ、または不規則なヒントを捨てる。良い引きプロトコルは、これらはまれであることを確認する必要があります。標準のパッチクランプ記録のために、先端の開口部は直径の1-3ミクロンにする必要があります。急なテーパー（鈍端）が同じ開口径のために抵抗を下げるために導く。形状と大きさは圧力の研磨によって変更することができます。

火災の研磨ピペット

1. フットペダルで制御されるプラチナの加熱フィラメントと研磨リグ（マイクロフォージ）を設定します。有用なキットは、ALAサイエンティフィック（CPM - 2）または類似の装置から入手可能です少しずつ組み立てることができます。
2. オプション：コート静電容量を減少させるとノイズ特性を向上させるために絶縁体とのピペット。我々は、歯科用ワックスを使用しています。 Sylgard 184™は、（また、PDMSと呼ばれるポリジメチルシロキサンエラストマー）もオプションです。
3. ワックスを使用する場合、近くの小さな溶融供給を維持する。ピペットを入力してからワックスを保つためにピペットの背面の空気の圧力で、液体のワックスに簡単に先端を浸して削除する。 Sylgardと、店舗準備冷凍アリコートのエラストマーと顕微鏡下でピペットの先端をペイント。エラストマーを治すために加熱する。
4. 研磨装置にピペットを（コーティングされたかどうか）に置き、先端〜フィラメントから50ミクロンをもたらす。加熱するとフィラメントが拡大することに留意してください。
5. 推奨 ：最適な抵抗と先端径のためのピペットの形状を変更するには"圧力研磨"のための別のプロトコルに従ってください。
6. 短い熱パルス（1〜2秒）は、ピペットの先端からワックスを除去し、ガラスを滑らかにするだけで十分です。
7. ほこりから守るために密閉ボックス10の成功ピペットの繰り返しで完成したピペットを置きます。

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ディスカッション

ここでプロトコル図示の電気生理学実験室での日常使用されており、細胞および動物用注射針を作るためにも使用されます。プログラム可能な引き手で、それには、さまざまな用途のためにピペットを作るのは簡単です。注意と慎重に、あなたのプーラーでフィラメントは、一年以上持続します。あなたの実験の成功をお祈りします。

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micropipette Puller	Instrument	Sutter Instrument Co.	P-97	Or similar instrument (e.g. Sutter P-87 or P-2000)
Glass Capillaries	Reagent	Sutter Instrument Co.	BF150-86-10	Or, similar capillary glass. To make filling the pipette easier, use a capillary with a glass filament.