ウィノグラツキーカラムの作成:堆積物サンプル中の微生物種を濃縮する方法

ソース: エリザベス・スーター¹, クリストファー・コルボ¹, ジョナサン・ブレイズ^1
1ワーグナーカレッジ生物科学科、1キャンパスロード、スタテンアイランドニューヨーク、10301

ウィノグラツキーのコラムは、堆積物微生物群集、特に硫黄循環に関与する人々を豊かにするために使用される、小型で囲まれた生態系です。このカラムは1880年代にセルゲイ・ウィノグラツキーによって最初に使用され、以来、光合成器、硫黄酸化剤、硫酸還元剤、メタンゲン、鉄酸化剤、窒素などの生物地球化学に関与する多くの多様な微生物の研究に適用されています。サイクラー、およびより多く(1,2)。

地球上の微生物の大半は、試験管やペトリ皿(3)で単離できないことを意味し、培養不可能と考えられています。これは、微生物が特定の代謝産物のために他の人に依存することを含む多くの要因によるものです。ウィノグラツキーのカラムの条件は、他の生物との相互作用を含む微生物の自然生息地を密接に模倣し、実験室で成長することを可能にする。そのため、この技術は、科学者がこれらの生物を研究し、それらが単独で成長することなく、地球の生物地球化学サイクルにとってどのように重要であるかを理解することを可能にします。

地球の環境は、土壌、海水、雲、深海堆積物など、あらゆる種類の生息地で繁栄する微生物でいっぱいです。すべての生息地では、微生物はお互いに依存しています。微生物が成長するにつれて、糖などの炭素が豊富な燃料や栄養素、ビタミン、酸素などの気道ガスなど、特定の基質を消費します。これらの重要な資源がなくなったら、異なる代謝ニーズを持つ異なる微生物が咲き、繁栄することができます。たとえば、Winogradsky 列では、微生物はまずカラムの下層の酸素を枯渇させながら、追加された有機材料を消費します。酸素が使い切られると、嫌気性生物が引き継ぎ、異なる有機材料を消費することができます。時間の経過とともに異なる微生物群相のこの連続的な発達は、継承(4)と呼ばれる。微生物の継承は、微生物の活動が堆積物の化学を変化させ、他の微生物の活動などに影響を与えるウィノグラツキーカラムで重要です。土壌や堆積物の多くの微生物も、基板の濃度に基づいて2種類の生息地間の遷移ゾーンである勾配に沿って生息しています(5)。グラデーションの正しい場所で、微生物は異なる基板の最適な量を受け取ることができます。ウィノグラツキーカラムが発達するにつれて、特に酸素と硫化物において、これらの自然勾配を模倣し始める(図1)。

図 1:ウィノグラツキーカラムで発生する_酸素(O2)および硫化物(H2S)勾配の表現。

ウィノグラツキーのカラムでは、池や湿地の泥と水が透明な柱に混入し、通常は光の中でインキュベートすることができます。追加の基板は、通常、セルロース、および硫黄の形で、炭素のコミュニティソースを与えるために列に追加されます。フォトシンセサイザーは、通常、堆積物の最上層で成長し始めます。これらの光合成微生物は、酸素を産生し、緑または赤褐色の層として現れるシアノバクテリアからなる(図2、表1)。光合成は酸素を生成しますが、酸素は水にあまり溶け込んでおらず、この層の下に減少します(図1)。これは、最上層の高濃度の酸素から下層のゼロ酸素に至るまで、酸素の勾配を作成します。酸素化層は好気性層と呼ばれ、酸素のない層は嫌気性層と呼ばれています。

嫌気性層では、利用可能な基板の種類と量、初期微生物の供給源、および堆積物の多孔性に応じて、多くの異なる微生物群集が増殖する可能性があります。コラムの下部には、嫌気的に有機物を分解する生物が繁栄します。微生物発酵は、セルロースの分解から有機酸を生成します。これらの有機酸は、硫酸塩を使用してそれらの有機物を酸化し、副産物として硫化物を生成する硫酸塩還元剤によって使用することができます。硫酸塩還元器の活性は、鉄と硫化物が黒い硫化物鉱物を形成するために反応するため、堆積物が黒くなる場合に示される(図2、表1)。また、硫化物も上向きに拡散し、カラムの下部に硫化物濃度が高く、カラムの上部が低い別の勾配を作成します(図1)。

カラムの中央付近では、硫黄酸化剤は、上からの酸素の供給と下からの硫化物を利用します。光の適切な量で、光合成硫黄酸化剤は、これらの層で開発することができます。これらの生物は、緑と紫の硫黄細菌として知られており、しばしば緑色、紫色、または紫色のフィラメントやしみとして現れます(図2、表1)。緑色の硫黄細菌は硫化物に対する耐性が高く、通常は紫色の硫黄細菌のすぐ下の層で発症する。紫色の硫黄細菌の上に、紫色の非硫黄細菌も発症する可能性があります。これらの生物は、硫化物の代わりに電子ドナーとして有機酸を使用して光合成し、しばしば赤、紫、オレンジ、または茶色の層として現れます。非光合成硫黄酸化剤は紫色の非硫黄細菌の上に発症する可能性があり、これらは通常白いフィラメントとして現れます(図2、表1)。さらに、ウィノグラツキー列にも気泡が形成される場合があります。好気性層の気泡は、シアノバクテリアによる酸素の産生を示す。嫌気性層の気泡は、嫌気的に有機物を分解し、副産物としてメタンを形成するメタノゲンの活性に起因する可能性が高い。

表 1:古典的なウィノグラツキーの列に上から下に現れるかもしれない細菌の主なグループ。各グループの生物の例を示し、生物の各層の視覚的指標を列挙する。ペリーら(2002年)とローガンら(2005年)に基づく。

1. セットアップ

1. Winogradsky 列を設定するには、基本的な消耗品が必要です。
   • シャベル、バケツ、ボトルを使用して、現場でサンプルを収集
   • ●約1Lの等級シリンダーやプラスチック製水筒などの縦透明容器
   • プラスチックラップとゴムバンド
   • 大きなミキシングボウルと大きなスプーンをかき混ぜる
   • 硫黄源(卵黄または硫酸カルシウム)
   • 有機炭素の供給源(セルロース、細断された新聞の形で)
   • 光源(日当たりの良い窓またはデスクランプ)
   • 湿地、湿地、池、または河川から採取された土壌または泥
   • 同じ生息地からの水
   • オプション このプロトコルで説明するオプションの実験の一部には、次のことが必要です。
     • テーブルソルト
     • 異なる色のセロファン
     • 鉄の供給源(釘やスチールウールなど)
     • 光源付き冷蔵庫

この実験では、淡水の生息地から水と堆積物を採取した。2つのウィノグラツキーカラムを構築し、開発することができました:室温で光の中でインキュベートされた古典的なウィノグラツキーカラム(図2A)と室温で暗闇の中でインキュベートされたウィノグラツキーカラム(図2B)。

図 2B:古典的な?...

ウィノグラツキー列は、相互依存性の微生物生態系の一例です。泥、水、および追加の炭素および硫黄基板を垂直列に混合した後、層状生態系は数週間にわたって別々の安定したゾーンに安定する必要があります。これらのゾーンは、底部の硫化物が豊富な堆積物と上部の酸素が豊富な堆積物との間の勾配に沿って特定の場所で繁栄する異なる微生物によって占められている。ウィノグラツ?...

1. Zavarzin G. (2006). Winogradsky and modern microbiology. Microbiology 75(6): 501-511. doi: 10.1134/s0026261706050018
2. Esteban DJ, Hysa B, and Bartow-McKenney C (2015). Temporal and Spatial Distribution of the Microbial Community of Winogradsky Columns. PLoS ONE 10(8): e0134588. doi:10.1371/journal.pone.0134588
3. Lloyd KG, Steen AD, Ladau J, Yin J, and Crosby L. (2018). Phylogenetically novel uncultured microbial cells dominate Earth microbiomes. mSystems 3(5): e00055-18. doi:10.1128/mSystems.00055-18
4. Anderson DC, and Hairston RV (1999). The Winogradsky Column & Biofilms: Models for Teaching Nutrient Cycling & Succession in an Ecosystem. The American Biology Teacher, 61(6): 453-459. doi: 10.2307/4450728
5. Dang H, Klotz MG, Lovell CR and Sievert SM (2019) Editorial: The Responses of Marine Microorganisms, Communities and Ecofunctions to Environmental Gradients. Frontiers in Microbiology 10(115). doi: 10.3389/fmicb.2019.00115
6. Stomp M, Huisman J, Stal LJ, and Matthijs HCP. (2007) Colorful niches of phototrophic microorganisms shaped by vibrations of the water molecule. ISME Journal. 1(4): 271-282. doi:10.1038/ismej.2007.59
7. Perry JJ, Staley JT, and Lory S. (2002) Microbial Life, First Edition, published by Sinauer Associates
8. Rogan B, Lemke M, Levandowsky M, and Gorrel T. (2005) Exploring the Sulfur Nutrient Cycle Using the Winogradsky Column. The American Biology Teacher, 67(6): 348-356. doi: 10.2307/4451860