プラークアッセイ:プラーク形成単位(PFU)としてウイルス定数を決定する方法

ソース: ティルデ・アンダーソン¹, ロルフ・ルード^1
1臨床科学ルンド, 感染医学の部門, ルンド大学生物医学センター, 221 00 ルンド, スウェーデン

バクテリオファージまたは単にファージと呼ばれる原核生物に感染するウイルスは、20^世紀初頭にTwort(1)とデレル(2)によって独立して同定された。ファージは、その治療価値(3)とヒト(4)、ならびにグローバルな生態系(5)への影響について広く認識されています。現在の懸念は、感染症の治療における現代の抗生物質の代替としてファージの使用に新たな関心を高めています(6)。本質的にすべてのファージ研究は、ウイルスを精製し、ウイルス力を定量する能力に依存しています, また、ウイルス力中剤として知られています.最初に1952年に記載された、これはプラークアッセイ(7)の目的であった。数十年および複数の技術の進歩後、プラークアッセイは、ウイルス力付き(8)の決定のための最も信頼性の高い方法の一つである。

バクテリオファージは、宿主細胞に遺伝物質を注入し、新しいファージ粒子の製造のための機械を乗っ取り、最終的に細胞リシスを通じて多数の子孫を放出させることによって、生き残る。その微小な大きさのために、バクテリオファージは、単に光顕微鏡を使用して観察することはできません。そのため、走査型電子顕微鏡検査が必要です(図1)。さらに、ファージは、餌食に宿主細胞を必要とするので、細菌のような栄養寒天プレート上で栽培することはできません。

図1:バクテリオファージの形態は、ここで大腸菌ファージによって例示され、走査型電子顕微鏡を用いて研究することができる。ほとんどのバクテリオファージは、カウドビレア(尾のバクテリオファージ)に属しています。この特定のファージは、非常に短い尾構造とイコサヘドラルヘッドを有し、ポドウイルスのファミリーに置きます。

プラークアッセイ(図2)は、宿主細胞の組み込みに基づいており、優先的に対相増殖において、培地に。これは、ウイルスの成長を維持することができる細菌の密な、濁った層を作成します。単離されたファージは、その後感染し、内で複製し、1つの細胞をlyseすることができます。各細胞がlysed細胞で、複数の隣接する細胞が直ちに感染する。いくつかのサイクルで、クリアゾーン(プラーク)は、そうでなければ濁板(図2B/図3A)で観察することができ、最初に単一のバクテリオファージ粒子であったものの存在を示す。試料の体積当たりのプラーク形成単位数(すなわちPFU/mL)は、生成されるプラークの数から決定することができる。

図2:プラーク形成単位(PFU)の試験は、サンプル中のバクテリオファージの数を決定するための一般的な方法である。(A)滅菌ペトリ皿のベースは、適切な固体栄養培地で覆われ、続いて、ソフト培地、感受性宿主細胞および元のバクテリオファージサンプルの希釈が混合される。ファージ懸濁液は、場合によっては、既に固化した柔らかい寒天の表面全体に均等に広がる可能性があることに注意してください。(B)宿主細菌の増殖は、上寒天層に細胞の芝生を形成する。バクテリオファージ複製は、宿主細胞リシスによって引き起こされるクリアゾーン、またはプラークを生成します。

図3:PFU試験の結果は、バクテリオファージによって生成された複数のプラークを示す。感受性宿主細胞のリシスにより、プラークは(A)完全クリアランス、または(B)耐性細菌の生成によって引き起こされる部分的な再増殖(または場合には、または温帯ファージによって、リソジェニックサイクル)。

特定の温帯ファージは、以前に記載された溶解性成長に加えて、リソゲン性のライフサイクルと呼ばれるものを採用することができます。リソジェニーでは、ウイルスは、宿主細胞(9)のゲノムにその遺伝物質を取り込むことを通じて潜伏状態を仮定し、多くの場合、さらなるファージ感染に対する耐性を与える。これは時々プラークのわずかな曇りを通して明らかにされる(図3B)。しかし、以前のファージ感染とは無関係にファージに対する耐性を進化させた細菌の再増殖のためにプラークがぼやけて見えることも注目に値する。

ウイルスは、限られた範囲の宿主細菌にのみ付着または吸着することができる(10)。宿主範囲は、CRISPR-Casシステム(11)のような細胞内抗ウイルス戦略によってさらに制限される。細菌サブグループによって表示される特定のファージに対する耐性/感受性は、歴史的に異なるファージタイプに細菌株を分類するために使用されてきた(図4)。この方法の有効性は、新しいシーケンシング技術によって上回っていますが、ファージタイピングは、例えば、臨床使用のためのファージカクテルの設計を容易にする、細菌とファージの相互作用に関する貴重な情報を提供することができます.

図4:異なる細菌株のファージ感受性。キューチバクテリウム・ニキビ株(A)AD27および(B)AD35を有する柔らかい寒天板を、21種類のC.にきび細菌食症で発見した。唯一のファージ11は、株AD35がすべてのファージに対する感受性を示しながら、AD27に感染し、殺すことができました。ファージタイピングと呼なこの技術は、ファージ感受性に基づいて細菌種と株を異なるサブグループに分割するために使用することができる。

1. セットアップ

1. 微生物を含む作業を開始する前に、作業スペースが殺菌されていることを確認してください(例えば、70%のエタノールで拭き取ります)。常にラボのコートと手袋を着用し、長い髪を縛り付け、傷が特によく保護されていることを確認してください。
2. 完成したら、すべての表面を殺菌し、手や手首を十分に洗浄/殺菌します。

2. プロトコル

1. LB メディアの準備
   注:宿主細菌株およびバクテリオファージに応じて、異なる液体培地は、宿主細菌株または異なる固体培地の初期培養に対してより適してもよいし、その後の増殖に対してより適してもよい。リソジェニースープ(LB)は、スープと寒天のためにこのプロトコルで使用されます。
   1. 200 mL蒸留水に4g LBを混ぜ、三量三回に、LBスープ、固体底寒天、柔らかいトップ寒天を混ぜます。オートクレーブ中のオーバーフロ

複数の技術の進歩にもかかわらず、プラークアッセイはウイルス力確定のためのゴールドスタンダード(PFUとして)であり、純粋なバクテリオファージ集団の単離に不可欠です。感受性の高い宿主細胞は、2層寒天板のトップコートで培養され、ウイルス複製を可能にする均質なベッドを形成する。溶解ライフサイクル中の単離されたバクテリオファージが細胞に感染し、細胞内で複製し、最終?...

1. Twort, F. An investigation on the nature of ultra-microscopic viruses. Lancet. 186 (4814): 1241-1243. (1915)
2. d'Hérelle, F. An invisible antagonist microbe of dysentery bacillus. Comptes Rendus Hebdomadaires Des Seances De L Academie Des Sciences. 165: 373-375. (1917)
3. Cisek AA, Dąbrowska I, Gregorczyk KP, Wyżewski Z. Phage Therapy in Bacterial Infections Treatment: One Hundred Years After the Discovery of Bacteriophages. Current Microbiology. 74 (2):277-283. (2017)
4. Mirzaei MK, Maurice CF. Ménage à trois in the human gut: interactions between host, bacteria and phages. Nature Reviews Microbiology. 15 (7):397. (2017)
5. Breitbart M, Bonnain C, Malki K, Sawaya NA. Phage puppet masters of the marine microbial realm. Nature Microbiology. 3 (7):754-766. (2018)
6. Leung CY, Weitz JS. Modeling the synergistic elimination of bacteria by phage and the innate immune system. Journal of Theoretical Biology. 429:241-252. (2017)
7. Dulbecco R. Production of Plaques in Monolayer Tissue Cultures by Single Particles of an Animal Virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 38 (8):747-752. (1952)
8. Juarez D, Long KC, Aguilar P, Kochel TJ, Halsey ES. Assessment of plaque assay methods for alphaviruses. J Virol Methods. 187 (1):185-9. (2013)
9. Clokie MRJ, Millard AD, Letarov AV, Heaphy S. 2011. Phages in nature. Bacteriophage. 1 (1):31-45. (2011)
10. Moldovan R, Chapman-McQuiston E, Wu XL. On kinetics of phage adsorption. Biophys J. 93 (1):303-15. (2007)
11. Garneau JE, Dupuis M-È, Villion M, Romero DA, Barrangou R, Boyaval P, Fremaux C, Horvath P, Magadán AH, Moineau S.. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320):67. (2010)